温度响应的黄曲霉毒素B_(1)纳米抗体重组表达、复性及生物活性

将不同长度类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptide,ELP)与纳米抗体融合表达,获得具有温度响应能力的抗黄曲霉毒素B_(1)(aflatoxin B_(1),AFB_(1))纳米抗体。采用递归定向连接克隆得到重组表达载体pET30a-G8-ELP20、pET30a-G8-ELP40、pET30a-G8-ELP60、pET30a-G8-ELP80,分别转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,表达后经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析显示4种融合蛋白均以不溶性包涵体形式存在于菌体沉淀中,对其进行变性处理后,分别采用稀释复性、可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)纯化、透析复性、柱上复性4种方式对包涵体蛋白进行复性。SDS-PAGE分析4种复性方式分别获得的4种融合蛋白,结果显示其纯度差异不显著,但ITC纯化蛋白得率最高,分别为83%、90.7%、89.5%、88.3%;间接竞争酶联免疫吸附实验测定复性后融合蛋白活性,结果表明由稀释复性法获得的G8-ELP80重组蛋白IC50最低(4.35 ng/mL);浊度分析法测得融合不同长度ELP标签纳米抗体的相变温度分别为45、38、32、28℃;圆二色谱分析显示4种融合蛋白二级结构均以β-折叠、β-转角为主,与预估结果相符。本研究将ELP标签与抗AFB1纳米抗体融合表达,实现了纳米抗体的温度刺激响应性,系统比较了不同复性方式对蛋白特性的影响,为后续AFB1检测分析提供了基础。

半巢式PCR法构建天然噬菌体单域重链抗体文库

目的:构建天然噬菌体单域重链抗体文库,淘选可应用于食品安全检测的单域重链抗体。方法:以未经免疫的健康羊驼(Lama pacos)外周血为起始材料,提取RNA反转录为cDNA,根据重链抗体保守序列设计引物,通过半巢式PCR法扩增获得全套重链抗体可变区编码基因,将其克隆至噬菌粒pHEN1,电转化大肠杆菌TG1得到初级抗体库,辅助噬菌体KM13感染后得到噬菌体展示库。采用固相淘选法分别对3种人工抗原进行淘选。结果:单域重链抗体编码基因得到有效扩增,经10次电转化获得初级文库,命名为SNAL,实际库容量达到1.6×107个独立克隆,菌落PCR鉴定结果表明,克隆效率约为87%,辅助噬菌体救援后得到的展示文库命名为SNA-PDL,滴度达1013CFU/mL。对3种不同人工抗原DON-MBSA、NOR-BSA和AFB1-OVA的淘选均有富集现象。结论:构建了天然噬菌体单域重链抗体文库,文库的多样性较好,可以用于后续淘选。

抗DON单域重链抗体序列分析及三维建模与对接

探讨应用分子模拟与对接技术预测抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)单域重链抗体(DONIV2)的三维结构及其与DON的结合模式。采用生物信息学相关工具和网站分析预测DONIV2的理化特性及其二级结构,同源建模方法获得三级结构,然后采用分子对接软件Autodock 4.2将三维结构模型与DON进行分子对接。二级结构和三级结构分析显示,DONIV2由10个β片层结构组成,CDR区为无规则卷曲结构,位于分子的一端,在CDR1、CDR2与CDR3之间形成1条宽度约为1.2 nm的凹槽结构。对接结果显示,可能的DON结合位点由Arg59、Arg103和Arg105等残基组成,他们位于CDR2和CDR3区域。表明通过分子模拟与对接相关工具获得了DONIV2的一、二、三级结构及可能的结合活性位点,为深入认识DON与抗体相互作用机理提供了理论指导,并为下一步DONIV2体外亲和力的成熟提供了线索。

三聚氰胺脱氨酶基因克隆表达及活性测定

从载体pUC57-MDA中获得经过大肠杆菌密码子偏好性优化的三聚氰胺脱氨酶编码基因,将该基因连接至表达载体6HisT-pRSET中,构建了重组表达质粒6HisT-pRSET-MDA,将其转化大肠杆菌BL21(DE3),得到重组工程菌BL-MDA并进行诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行分析并测定酶活性。SDS-PAGE电泳分析结果显示,表达上清液在53 000处有明显的蛋白质条带,与理论相对分子质量的吻合,其脱氨酶活性达5.61 U。

基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的一步酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B_1

从噬菌体展示的抗黄曲霉毒素B1(AFB_1)纳米抗体文库中,通过四轮亲和淘选,得到抗AFB_1纳米抗体G8。将编码纳米抗体G8的基因与碱性磷酸酶(AP)基因融合,构建了重组融合表达载体pET25b(+)-G8-AP,将其转化大肠杆菌BL21(Rosetta,DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合基因表达。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白G8-AP为可溶性表达,Ni^(2+)-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,对硝基苯磷酸二钠(pNPP)法测得纯化后的G8-AP的碱性磷酸酶比活力为(364.5±8.3)U/mg。ELISA检测结果表明,G8-AP具有特异识别AFB1的活性,与其它真菌毒素(AFB_2、AFG_1、AFG_2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B_1)无交叉反应。基于G8-AP建立了检测AFB1的一步ELISA法。在优化的条件下,即甲醇浓度20%、盐离子浓度20 mmol/L、pH 7.4条件下,方法的半数抑制浓度(IC_(50))为19.8 ng/mL,线性范围为4.3~92 ng/mL,检出限为2.6 ng/mL。对玉米和小麦样品加标回收实验结果表明,基质对本方法的干扰不明显,可用于实际样品检测。

抗AFB_1单域重链抗体文库淘选方法的研究

比较两种从噬菌体展示文库中淘选抗黄曲霉毒素B1单域重链抗体的方法,并为淘选针对小分子物质的单域重链抗体提供参考。采用固相淘选技术,以黄曲霉毒素B1人工抗原为靶分子,淘选天然单域重链抗体库,分别采用Gly-HCl法和AFB1竞争法洗脱结合噬菌体,对洗脱物进行滴度测定,以回收率和富集度为指标,对两种洗脱方法进行比较。采用phage-ELISA法鉴定噬菌体克隆,并对阳性克隆进行交叉反应分析以及序列测定。滴度测定结果显示,Gly-HCl法回收率比竞争法高5～10倍。分别随机挑取20个单克隆进行phage-ELISA鉴定,其中,Gly-HCl洗脱法未获得阳性克隆,AFB1竞争洗脱法得到8个阳性克隆。序列测定结果显示,这8个克隆均编码单域重链抗体。

丝状真菌基因敲除技术研究进展

丝状真菌在自然界分布广泛,与人类的生产、生活密切相关。近年来,对于其基因功能的研究取得了较大的进展,一系列转化和基因操作技术已在不同的丝状真菌中得到运用。许多对于工业、农业和医药卫生具有重要意义的丝状真菌已经完成或正在进行全基因组序列测定。作者简述了丝状真菌基因敲除的历史,重点介绍了近年来基因敲除技术在丝状真菌研究中的进展,并对其在丝状真菌基因功能研究、工业菌株改良等方面进行了展望。

抗黄曲霉毒素B_1纳米抗体的原核表达、纯化及活性分析

表达和纯化抗黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）纳米抗体（G8）,并分析纳米抗体的热稳定性及生物学活性,建立基于纳米抗体检测AFB1的ELISA方法。将编码抗AFB1纳米抗体的基因亚克隆至原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21（Rosetta,DE3）,IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析蛋白表达情况;采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析纳米抗体的热稳定性、有机溶剂耐受性、盐离子耐受性及耐酸碱性。结果显示,在大肠杆菌中成功表达可溶性的抗AFB1纳米抗体,表达量为80 mg/L,在25~65℃之间,抗体具有良好的热稳定性。在5%甲醇、p H7.4、10 mmol/L PBS条件下,建立了G8-ELISA检测AFB1的方法,该方法的半抑制浓度（IC50）为4.61 ng/m L,线性范围为0.95~42.45 ng/m L。

抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇纳米抗体随机突变与筛选

采用易错聚合酶链式反应技术,对来源于天然纳米抗体文库的抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)纳米抗体进行随机突变,通过优化和比较突变条件,构建了突变分布均匀的突变文库。噬菌体展示技术对突变文库进行了6轮筛选,获得了8种突变序列,其检测信号为野生型2.1倍。多序列比对及三维结构建模分析表明,突变序列的突变位点集中于互补决定区与框架区连接的区域,并且部分序列出现了可以形成二硫键的氨基酸残基。研究结果为抗DON纳米抗体进一步的深度突变和改造提供了线索,同时可为其他抗小分子纳米抗体的改造提供借鉴。

软饮料中人工合成色素快速测定试纸条的研制（英文）

基于聚酰胺薄膜与人工合成色素之间的特异性吸附的原理,建立一种快速、低成本的测定软饮料中最常用的3种人工合成色素(胭脂红E124、柠檬黄E102、日落黄E110)的方法。在优化后的检测条件下,3种色素的最低检测限分别为0.4、0.3 mg/L和0.4 mg/L,检测时间10 min。对14个市售样品进行检测,结果表明,建立的快速检测方法与薄层色谱和高效液相色谱两种方法的结果吻合。该方法操作简单、不需要仪器设备,凭肉眼判读,可用于现场检测和快速筛查,为控制和监测合成色素的滥用或过量添加提供技术途径。

绿色包装材料魔芋葡甘聚糖可降解膜的制备研究

以魔芋精粉为主要原料,利用魔芋葡甘聚糖溶胶在适当条件下的成膜性制备可降解绿色包装膜材料。通过单因素实验和正交实验,探讨了精粉浓度、增塑剂和补强剂的添加量、干燥温度、pH等因素对膜的制备及膜性能的影响,确定了膜制备的最佳工艺条件：即精粉浓度1％(g/mL),增塑剂6％,补强剂6％,干燥温度60℃,pH9～10。

前列腺特异性膜抗原胞外区的真核表达及其纳米抗体的淘选

目的寻找能够特异性与前列腺特异性膜抗原(prostate-specific membrane antigen,PSMA)胞外区结合的纳米抗体。方法通过RT-PCR技术在真核细胞HEK-293中重组表达PSMA胞外区。以该重组蛋白为包被抗原,采用固相淘选的方法在天然纳米抗体噬菌体展示库中淘选能够与之特异性结合的噬菌体,以Phage-ELISA方法筛选出具有结合活性的噬菌体克隆。通过细胞ELISA和细胞免疫荧光技术再次验证分子水平淘选到的阳性噬菌体克隆。结果测序证明编码PSMA的重组DNA片段序列正确,Western blot验证该重组蛋白成功表达。4轮固相淘选天然库使具有结合活性的噬菌体克隆得到了有效富集,阳性率从8.3%提高到64.6%。细胞ELISA测值表明PSMA表达阳性细胞明显高于阴性细胞[PSMA+:(0.621±0.043);PSMA-:(0.148±0.014),P<0.01];细胞免疫荧光亦证实分子水平淘选的阳性噬菌体与表达PSMA阳性细胞能发生特异性结合。结论从天然纳米抗体噬菌体库中淘选得到了在分子和细胞水平均能与PSMA胞外区特异性结合的阳性噬菌体克隆。

黄曲霉和寄生曲霉pksA基因部分序列的同源性分析

比较寄生曲霉和黄曲霉pksA基因部分序列同源性。方法:采用RT-PCR从寄生曲霉AS3.4407和黄曲霉菌AS3.4409中克隆得到pksA基因部分序列,经克隆后测序。结果:通过比对分析发现该两株菌pksA基因同源性可达98.0%。

催化光度法测定三聚氰胺脱氨酶活性

建立一种测定三聚氰胺脱氨酶活性的催化光度法。利用Berthelot显色反应,通过测定单位时间内释放出的氨气量推算三聚氰胺脱氨酶的活性,并通过单因素试验和L9(34)正交试验优化测定条件。结果表明:最佳显色条件为水杨酸显色液加入量1.2mL、次氯酸钠溶液加入量0.3mL、显色反应时间40min、测定波长650nm;最佳酶促反应条件为三聚氰胺底物加入量0.2mL、粗酶液加入量60μL、酶促作用时间30min;在上述条件下,测得酶比活力为132.41U/L,批内批间变异系数范围分别为0.81%～1.19%和1.27%～1.69%。催化光度法对三聚氰胺脱氨酶酶活的测定,具有操作快速简便、灵敏度高、重复性好的优点。

微视频案例教学在生物化学课程中的实践

将微视频案例教学应用在生物化学的理论教学和实验教学中,分别对相同专业不同年级学生进行实验研究。结果表明,微视频案例教学有助于提高对课堂知识的理解,笔试成绩、长时记忆和理解力均高于传统教学法,对创新能力和自学能力的提升学生认可程度较低。结果显示:微视频案例教学对学生主观学习有明显的促进作用,这可以为类似的案例教学的应用提供较好的教学参考。

检测黄曲霉毒素生物合成相关基因芯片的研制

研究比较成熟的可用于分析黄曲霉毒素生物合成相关基因的芯片分析技术。芯片点阵后依次通过温浴2h,650mJ/cm2紫外交联30s、80℃烘烤2h、预杂交45min、清洗、干燥等步骤,最后与待测样品在42℃杂交16h,可获得低背景高质量的芯片。本实验所用探针来源于寄生曲霉,而待测样品选择了黄曲霉菌株,芯片扫描结果显示荧光信号稳定,与反转录PCR扩增结果一致,并且无背景干扰。证明探针设计合理,实验方法可靠。初步建立了用芯片检测与黄曲霉毒素生物合成相关基因的技术平台。

伏马菌素B_1胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制

目的:为制备一种快速检测玉米中伏马菌素B_1(FB_1)胶体金免疫层析试纸条。方法:采用碳化二亚胺法合成检测抗原FB_1-BSA,柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,辛酸-饱和硫酸铵法对抗FB_1单克隆抗体腹水进行纯化,将金标抗体喷于金标垫,检测抗原FB_1-BSA(T线)和羊抗鼠二抗(C线)喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)。结果:得到的单克隆抗体效价为1.28×105。该试纸条的NC膜喷涂的检测抗原浓度为200μg/m L,羊抗鼠二抗浓度为1.0 mg/mL,喷涂量分别为0.74μL/cm,试纸条灵敏度为20 ng/mL,检测时间只需5 min,试纸条于4℃至少可保存12个月。结论:采用制备的试纸条对玉米实际样品进行检测,检测结果与高效液相和酶联免疫吸附法检测结果相一致,说明该试纸条适合现场快速检测伏马菌素B_1。

米曲霉3.951菌株与RIB40菌株高产原生质体的制备及再生条件的研究

针对2株米曲霉进行原生质体制备条件的研究,比较了制备材料、菌龄、渗透压稳定剂、复合酶配比、酶解时间以及酶解温度对米曲霉原生质体形成和再生的影响。结果表明,2株米曲霉原生质体制备的最适宜条件稍有差异,其中米曲霉3.951菌株原生质体制备和再生的适宜条件是:以菌丝为制备材料,菌龄为14 h,渗透压稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度为35℃;米曲霉RIB40的适宜条件是:以菌丝制备材料,菌龄为12 h,渗透要稳定剂为0.8 mol/L NaCl,复合酶配比是为1.0%纤维素酶、1.0%裂解酶、0.l%蜗牛酶,酶解时间为3 h,酶解温度是35℃。在优化条件下米曲霉3.951菌株释放的原生质体达6.43×107个/g,再生率可达23.5%,米曲霉RIB40释放的原生质体可达4.24×107个/g,再生率达22.41%。

抗赭曲霉毒素A五价纳米抗体的表达及分析

利用霍乱毒素B亚基(B subunit of Cholera toxin,CTB)能自组装形成五元环状结构,将霍乱毒素B亚基与纳米抗体(VHH28)进行融合从而达到纳米抗体多聚化的目的。将重组载体p ET25b(+)-CTB-VHH28转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,SDS-PAGE凝胶电泳分析融合蛋白表达情况。结果显示CTB-VHH28为可溶表达,其中单体分子量大小约30 kDa,五聚体分子量大小约150 kDa,均与预测的分子量大小一致;确定了其最优表达条件为:IPTG浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为16℃,诱导时间为10 h。经过镍柱纯化后成功得到了纯度较高的五价纳米抗体,表达量为20 mg/L。对其活性进行测定,结果表明CTB-VHH28能与赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)特异性结合,在2.5%甲醇条件下,间接竞争ELISA半抑制浓度(IC_(50))为0.38 ng/mL。热稳定性及甲醇耐受性结果显示,CTB-VHH28在25~55℃具有良好的热稳定性,反应体系中甲醇浓度低于20%时,竞争抑制率变化不大,具有较好的甲醇耐受性。结论:本研究所制备的五价纳米抗体可以用于OTA检测。

红曲米中Monacolin K提取条件的优化

功能性红曲米含有Monacolin K,常作为一味能调节人体血脂水平的传统中药,实验采用响应面法对红曲米中Monacilin K的提取条件进行优化。结果表明:当提取条件为乙醇浓度67%,提取时间65min,温度43℃,料液比116,功率150 W时,提取的Monacolin K预测值为21.02mg·g-1,实际检测值为21.00mg·g-1,比商家提供的含量提高了40%。