狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研究进展

简要介绍狂犬病的流行现状、发病机制、狂犬病病毒G蛋白中和抗原位点及其单克隆抗体的中和机制。重点介绍目前全球已上市或处于研发阶段的多种狂犬病病毒单克隆抗体药物的筛选发现技术、识别位点、作用方式以及体内外病毒中和效果,分析上述单克隆抗体在目前狂犬病暴露后治疗的应用推广中存在的问题,并针对当前狂犬病免疫球蛋白存在的血源供应、中和效价、质量控制及潜在病毒感染等问题,指出狂犬病病毒单克隆抗体研发的重要性,尤其是抗体的中和效价和中和广度,进而提出针对狂犬病病毒遗传谱系Ⅱ/Ⅲ的全人源单克隆抗体开发,以及针对G蛋白多个抗原位点的单克隆抗体鸡尾酒(mAb cocktail)疗法是当前在狂犬病暴露后预防性单克隆抗体药物研发中亟待解决的问题。

2.1亚型猪瘟病毒流行株E2蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为获得仅与我国基因2.1亚型猪瘟病毒(CSFV)流行株反应的单克隆抗体(MAb),并揭示疫苗株与流行株E2蛋白抗原氨基酸的差异,本研究利用基因2.1亚型重组质粒p FastBac1-JL23 E2通过杆状病毒表达重组E2蛋白(rE2),并采用Ni柱纯化后经SDS-PAGE检测r E2的表达及纯化效果;采用western blot鉴定r E2的反应原性。SDS-PAGE及western blot结果表明经杆状病毒表达了基因2.1亚型CSFV E2蛋白,且其纯化效果和反应原性均较好。采用杂交瘤技术制备2.1基因亚型CSFV E2蛋白的单克隆抗体(MAb),采用亲和层析法纯化该MAb,采用BCA法测定其浓度及亚类。将79株1.1、2.1、2.2和2.3基因亚型的CSFV及1.1基因亚型的HCLV株和SM株感染PK-15细胞,72 h后采用IFA检测MAb与不同基因型CSFV的反应性;采用western blot鉴定MAb与10个基因亚型共18种CSFV代表株E2蛋白的反应性。采用IFA鉴定MAb与不同基因型CSFV的中和活性。结果显示,经IFA筛选后共获得16株分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株。其中仅一株MAb TCH061与所有2.1基因亚型(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j、2.1k、2.1l、2.1m、2.1n)CSFV感染的细胞反应后出现绿色荧光,与基因1.1亚型HCLV疫苗株和SM株以及其他基因型CSFV感染的细胞反应后均无绿色荧光;western blot结果显示,该MAb能够识别2.1基因亚型CSFV E2蛋白(2.1a、2.1b、2.1c、2.1g、2.1h、2.1i、2.1j),在90 ku处出现特异性条带,而与其他基因型CSFV E2蛋白均不反应。表明TCH061为2.1基因亚型CSFV E2蛋白特异性的MAb。MAb的纯化结果显示,在50 ku和25 ku处有明显条带,其浓度为1.70μg/μL且该MAb TCH061重链为Ig G2a,轻链为κ链。中和活性结果显示,TCH061对JL^(23)株(2.1b)、GDLF1株(2.1c)有一定的中和活性,但不能中和C株。分别以GD53株E^(24)个不同区域的截短蛋白为抗原通过western blot初步确定MAb识别抗原表位的区域。利用CLC Sequence Viewer比对与MAb反应的CSFV E2蛋白氨基酸序列的差异,通过SWISS-MODEL预测MAb抗原表位的关键氨基酸位点。利用杆状病毒表达CSFV JL^(23)株各位点突变后的E2蛋白,采用western blot鉴定各突变的E2蛋白与MAb TCH061的反应性。Western blot结果显示,TCH061的抗原表位位于E2蛋白的aa1~aa90,且其识别CSFV E2蛋白P^(20)不识别L^(20)的CSFV。通过SWISS-MODEL预测E2蛋白氨基酸序列的I18、G^(19)、P^(20)、L^(21)、G^(22)、A^(23)和E^(24)在空间上比较接近;MAb TCH061与JL^(23)株I18M突变的E2蛋白反应,与G^(19)K、P^(20)L和L^(21)P突变的E2蛋白均不反应,与G^(22)K突变的E2蛋白反应性较弱,与HCLV E2蛋白不反应,但与HCLV L^(20)P突变的E2蛋白反应。证实TCH061的抗原表位为^(19)GPLG^(22),经Py MOL结构模拟确定其为空间构象表位;且除了aa^(20),其他位点在各基因型CSFV中均非常保守,表明P^(20)是2.1基因亚型CSFV流行株E2蛋白抗原表位的关键氨基酸。综上所述,本研究首次获得一株区别于CSFV疫苗株和2.1基因亚型CSFV流行株的MAb TCH061,揭示了疫苗株与流行株E2蛋白氨基酸位点的差异,为研发猪瘟疫苗和CSFV流行株感染的血清学鉴别检测方法的建立提供了重要的MAb资源。

猪瘟病毒石门株特异cDNA片段的扩增与序列分析

以猪瘟病毒感染细胞中提取的细胞总ＲＮＡ为模板，应用反转录─聚合酶链反应，在化学合成的两对特异引物引导下，成功地扩增出了两个石门株的ｃＤＮＡ片段。电泳证明它们的大小与预计的３４６ｂｐ和１２０ｂｐ完全一致。酶切分析证实了它们应有的酶切位点。随后对这两个片段进行了克隆和序列测定，并与国外株的序列进行了比较。结果证明本实验扩增的两个ｃＤＮＡ序列与Ａｌｆｏｒｔ株和Ｂｒｅｓｉａ株的同源性分别是９５．２％和９８．５％。

猪瘟病毒反义cDNA片段的化学合成及克隆

猪瘟是猪最严重的传染病,流行于世界上许多国家和地区,并造成严重的经济损失。反义核酸对多种病毒增殖的抑制作用已被证实。为了探索反义核酸途径在抗猪瘟基因工程育种中的应用前景,我们化学合成和克隆了猪瘟病毒(Hog cholera virus)反义cDNA片段,现将结果报告如下。

荷叶生物总碱对肥胖高脂血症大鼠减肥作用的实验研究

采用肥胖高脂血症大鼠模型 ,观察荷叶生物总碱对大鼠体重、体脂及血脂的影响 ,结果表明荷叶生物总碱明显抑制肥胖大鼠的体重增长 ,影响其肥胖程度且可使肥胖高脂血症大鼠TC、TG及AI下降。

宁红瘦身含片对肥胖高脂血症模型大鼠作用研究

目的 观察宁红瘦身含片 (NHSTs)对肥胖高脂血症模型大鼠的减肥降脂作用。方法 采用肥胖高脂血症大鼠模型 ,观察宁红瘦身含片对肥胖大鼠体质量、体脂及血脂的影响。结果 宁红瘦身含片可明显抑制肥胖大鼠的体质量增长 ,影响其肥胖程度 ,且可使肥胖高脂血症大鼠TC ,TG及AI下降。结论 宁红瘦身含片具有较明显的抑制肥胖大鼠体质量增长及降脂作用。

我国猪瘟的流行现状、原因与防制对策

猪瘟(CSF)是我国四大畜禽疫病之一,至今已流行70多年。我国于1954年成功研制了猪瘟兔化弱毒疫苗(Hog Cholera Lapinised Virus,HCLV),随即在全国范围内推广应用,并于1956年提出了消灭猪瘟的规划。由于长期贯彻预防为主的指导思想,坚持广泛接种猪瘟兔化弱毒疫苗的综合性防治措施,本病在我国已经得到有效控制,大规模的爆发流行基本停止,但是猪瘟并未被扑灭,该病仍在全国范围内不间断地小规模地散发流行,消灭猪瘟仍然还有很长的路要走。

猪瘟病毒保护性抗原E2蛋白单抗的制备及其抗原表位的初步分析

应用大肠杆菌表达的猪瘟病毒主要保护性 E2抗原决定簇蛋白和全长 E2基因构建的 DNA疫苗免疫 BAL B/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与 SP2 /0骨髓瘤细胞进行融合 ,经克隆和间接 EL ISA筛选 ,获得了 A11、B2、E3、H6、D5、D86株稳定分泌抗猪瘟病毒 E2蛋白单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞株。它们的腹水效价在 1∶ 80 0～ 1∶ 2 10 0 0 0之间。抗体类型鉴定结果表明 ,A11、E3、H6、D5和 D8为 Ig M类型 ,B2为 Ig G类型。随后用蛋白 A凝胶层析法和 PEG沉淀法分别纯化了 Ig G和 Ig M单抗。对纯化单抗进行的抗原识别表位研究结果初步表明 ,6株单抗可能识别 3种不同的E2抗原表位。

犬瘟热病毒反转录-聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用

根据Ｂａｒｅｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录，以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ扩增条件进行了优化。经鉴定，以此对引物进行的ＰＣＲ扩增，得到了与设计片段大小和酶切位点相同的产物，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸，这表明此方法为特异性的。对２７条（只）临床病例和３２份细胞培养物进行检查，并与电子显微镜负染检查结果进行了比较。初步应用研究的结果表明，此方法可用于犬瘟热病毒的临床诊断和实验研究。

我国猪瘟的流行病学现状分析

根据调查、收集的猪瘟 (CSF)临床与流行病学资料 ,分析了全国 16个省市自治区 48个发病猪场 (疫点 )的流行状况。调查结果表明 ,我国的CSF流行在较大范围内以临床表现不典型的CSF为主 ,发病多见于 3月龄以下的仔猪 ,发病率与死亡率普遍较高 ,流行规模以局部流行为主 ,同一猪场中育肥猪与种猪的发病率很低。但母猪多呈隐性感染 ,部分感染母猪表现出繁殖障碍 ,因此认为隐性感染母猪可能是仔猪感染的重要传染源。在某些地区 ,仍然流行着高发病率和致死率的急性、典型CSF。所调查的猪群具有较高防疫注射密度 ,但仍有CSF发生 ,可能表明猪群的免疫水平不高。

以重组mE2蛋白为抗原建立检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法的研究

以在Ｅ．ｃｏｌｉ高效表达的猪瘟病毒Ｅ２基因主要抗原编码区（ｍＥ２）为抗原，以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的兔抗猪ＩｇＧ为二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。经检测筛选出最佳反应条件为：１２μｇ／孔纯化的Ｅ．ｃｏｌｉ表达的ｍＥ２重组蛋白包被酶标板，用１０％的兔血清或马血清进行封闭，以正常Ｅ．ｃｏｌｉ裂解上清液稀释待检血清。试验表明应用重组ｍＥ２蛋白作为诊断ＨＣＶ抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。

猪瘟病毒E2基因的定点突变、在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的免疫原性

用重组PCR技术对猪瘟病毒石门株E2基因进行了定点突变 ,然后将突变后的基因克隆至表达载体质粒pET 2 8a(+ )中 ,构建成重组质粒pETE2。将pETE2转入受体菌BL2 1(DE3 )plysS中 ,在IPTG的诱导下 ,重组转化菌可高效表达目的基因 ,表达量平均可达菌体蛋白总量的 2 8%。免疫印迹和间接ELISA表明所表达的蛋白是CSFV特异性的。

应用多联PCR对引发猪繁殖障碍有关病毒的检测Ⅱ.JEV、PPV、PRRSV、PRV单项PCR检测方法的建立

在利用计算机设计出检测流行性乙型脑炎病毒 ( JEV)、猪细小病毒 ( PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)、猪伪狂犬病病毒 ( PRV)的多联 PCR引物的基础上 ,分别进行各单项 PCR检测相应病毒试验 ,确定了各单项 PCR反应条件范围 ,并对各 PCR扩增产物进行了点杂交和部分测序鉴定。用单项 PCR对感染猪相关病毒的检测证实 ,本试验已经建立了有效、特异、敏感的检测 JEV、PPV、PRRSV、PRV的单项 PCR技术 ,为进一步建立多联

我国部分地区猪瘟病毒流行株的基因差异

采用 RT-PCR方法 ,从我国 1 0个省、市、自治区收集的 2 3个猪瘟病毒 ( CSFV)流行毒株中 ,扩增了CSFV E2基因中主要抗原位点编码区。对各扩增片段进行了序列测定 ,通过计算机分析构建了系统发生树 ,并确定了它们间的遗传相关性。结果表明 ,2 3个流行毒株中的 1 8株属基因 群 ,占 78.2 6%;另外 5个流行株与传统石门强毒、兔化弱毒株属基因 群 ,占 2 1 .74 %。两群间测序区的核酸同源性只有 78.90 %。此外 ,根据序列差异程度 ,将基因 群流行株分为 3个亚群 ,各基因群 CSFV在地域分布上未发现有明显的特征性。本研究初步揭示了我国较大范围内流行的 CSFV毒株与传统的石门强毒和疫苗用兔化弱毒在抗原基因上存在较大的差异 。