红鳍东方鲀Sirt1基因的克隆及其原核表达

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。

红鳍东方鲀PPARγ真核基因表达载体构建及亚细胞定位研究

[目的]旨在克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,并通过构建真核表达载体pCMV-3Tag-4A-PPARγ,分析myc-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞的表达及亚细胞定位。[方法]利用RT-PCR技术克隆红鳍东方鲀PPARγ基因的cDNA,构建pCMV-3Tag-4A-PPARγ重组质粒,转染至大鼠L6细胞,共聚焦显微镜下观察myc-PPARγ的亚细胞定位。[结果]红鳍东方鲀PPARγ基因cDNA ORF全长1557 bp,共编码518个氨基酸,pCMV-3Tag-4A-PPARγ融合蛋白在大鼠L6细胞核中表达,为深入探讨鱼类PPARγ生物学功能奠定了基础。