用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗

目的研究微载体培养Vero细胞生产狂犬疫苗。方法搅拌式生物反应器培养Vero细胞,待细胞在微载体上长成单层后,用狂犬病毒aG株感染细胞。培养5d后,开始灌流收获病毒液,每天取样测定病毒滴度。经灭活后制备成试验疫苗,进行效力试验。结果3次培养,细胞密度均达到1×106/ml以上,病毒滴度都在106LD50以上,3批试验疫苗的效价分别达到5.88、6.49和5.98IU/ml。结论在生物反应罐中用微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗工艺合理,所获免疫原性良好,适用于工业化生产,有较好的应用前景。

生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒

目的应用生物反应器大规模培养脊髓灰质炎病毒。方法用7L、75L和550L生物反应器逐级放大培养Vero细胞,每天取样进行细胞计数。在550L生物反应器中培养脊髓灰质炎病毒,观察细胞病变,并检测病毒感染性滴度。结果一级细胞培养(灌流培养法)、二级细胞培养(循环培养法)和三级细胞培养(批培养法)的平均细胞密度分别为2.79×106、2.38×106和1.04×106个/ml,一级培养的细胞倍增数最高;病毒培养体积达350L,病毒收获液滴度大于7.625lgCCID50∕ml。结论通过三级放大工艺,可大规模培养脊髓灰质炎病毒。

用生物反应器制备乙脑灭活疫苗的研究

目的用生物反应器制备乙脑纯化灭活疫苗。方法用搅拌式生物反应器培养Vero细胞,接种并培养乙型脑炎病毒,将收获的病毒液进行灭活和纯化。结果细胞密度都增至2.4×106ml-1以上,病毒滴度都>7.25lgLD50/ml。结论用生物反应器制备乙脑灭活纯化疫苗的工艺合理,可以生产出高滴度的乙型脑炎病毒液。

学龄前儿童甲型肝炎疫苗免疫效益评价

目的 对学龄前儿童甲肝病毒活疫苗和灭活疫苗的接种效益进行了分析评价。方法 采集昆明市部分学龄前儿童血样本，检测HAV总抗体，分别计算接种两种甲肝疫苗的成本效益值（BCR）。结果 两种甲肝疫苗在1～2岁组BCR值均最高，甲肝减毒活疫苗BCR值在各年龄组均略高于灭活疫苗。结论 我市儿童在1～2岁时接种甲肝疫苗可以取得最佳经济效益。

白喉产毒培养基中铁离子磺基水杨酸分光光度检测方法的建立及验证

目的 建立测定白喉产毒培养基中微量铁离子的磺基水杨酸分光光度法,并进行验证及初步应用。方法 全光谱扫描铁-磺基水杨酸络合物最大吸光度;以铁磺基水杨酸络合物吸光度与铁离子含量进行线性回归,建立培养基中铁离子检测方法,并对方法 进行稳定性、准确性和精密性验证;考察Ca^(2+)、Mg^(2+)、K^(+)、Na^(+)以及显色反应物对方法 的影响;采用磺基水杨酸分光光度法测定自制及市售白喉产毒培养基中微量铁离子;分别采用磺基水杨酸分光度法及常用方法 亚铁嗪比色法、邻菲啰啉分光光度法检测两种培养基(牛肉胰酶消化液、5%多聚蛋白胨)中铁含量,比较3种方法 的检测结果。结果 铁-磺基水杨酸络合物在波长425 nm处有最大吸光度;铁离子浓度在1~0.05μg/mL范围内与吸光度存在良好的线性关系,检测限为0.05μg/mL,标准曲线方程为:Y=0.027 9X+0.046 1,R^(2)>0.99;每间隔5 min测定1次A425值,各浓度标准品A_(425)值的变异系数(CV)均小于5%;低(0.05μg/mL)、中(0.5μg/mL)、高浓度(1μg/mL)Fe^(3+)标准品溶液连续测定3次,每个浓度平行测定9组的CV均<5%,回收率均>95%;Ca^(2+)、Mg^(2+)、K^(+)、Na^(+)、15μL磺基水杨酸(20%)和50μL氢氧化氨(1:1)不对检测方法 构成干扰;产毒培养基测定结果 与白喉细菌产毒结果 一致;3种检测方法 结果 一致。结论 建立的磺基水杨酸分光光度法能够准确、有效地测定白喉产毒培养基中微量铁离子含量。

皮内免疫部分剂量组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗的免疫持久性

目的评价皮内免疫(intradermal,ID)部分剂量组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗(diphtheria-tetanus-acellular component pertussis and Sabin-derived inactivated poliovirus vaccine,DTacP-sIPV)的免疫持久性。方法将40只Wistar大鼠(雌雄各半)分别经ID部分剂量(DTacP-sIPV 1/5和1/10剂量,即1/5D和1/10D ID组)及肌肉注射(intramuscular,IM)全剂量DTacP-sIPV(全剂量IM组),同时设空白对照组(ID PBS)。于0、1、2月共免疫3次,末次免疫后12个月经尾静脉采血,分离血清。微量中和试验法检测抗脊髓灰质炎病毒中和抗体滴度,间接ELISA法检测大鼠血清中抗白喉毒素(diphtheria toxin,DT)、破伤风毒素(tetanus toxin,TT)、百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)的IgG抗体滴度,并计算抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)及抗体阳性率。末次免疫后12个月,经雾化吸入百日咳杆菌气雾进行攻击,攻击时间为30 min,于气雾攻击后2、5、14 d检测各组大鼠白细胞数及肺、气管、鼻部位的菌落克隆形成数(colony-forming unit,CFU)。结果与全剂量IM组比较,1/5D和1/10D ID组脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗体阳性率差异均无统计学意义(P均>0.05),空白对照组各型抗体阳性率均为0。1/5D、1/10D ID及全剂量IM组DT、TT、PT、FHA和PRN的IgG抗体阳性率均为100%,空白对照组IgG抗体阳性率均为0。与攻击后2 d比较,空白对照组大鼠经百日咳杆菌气雾攻击后5 d的白细胞数明显升高(F=3.48,P<0.05),随后开始下降;其他组均随时间的延长保持平稳(F=0.14~1.30,P>0.05)。气雾攻击后,空白对照组大鼠肺部细菌载量明显高于其他3组(F=19.00~206.00,P<0.05),攻击后14 d仍可检测到百日咳杆菌;除空白对照组外,其他3组大鼠肺部细菌载量均于攻击后5 d达峰值,14 d时基本清除,各时间点组间差异无统计学意义(F=1.14~1.25,P>0.05)。空白对照组各时间点气管和鼻部细菌载量略高于其他组,但差异均无统计学意义(F=0.71~3.54,P>0.05);除空白对照组外,其他3组大鼠气管和鼻部细菌载量较接近,差异均无统计学意义(F=0.75~3.41,P>0.05)。结论ID 1/5D DTacP-sIPV可诱导大鼠产生针对疫苗各组分的持久保护性抗体,本研究为ID部分剂量DTacP-sIPV免疫策略的制订提供了实验依据。

云南西双版纳百日咳博德特氏菌分离株抗原基因特征分析

目的比对云南省西双版纳地区新的百日咳临床分离株与疫苗株及其他地区流行的百日咳博德特氏菌基因特征,为百日咳的防控提供科学依据。方法对2019年10—12月从云南省西双版纳州人民医院采集的4株百日咳临床分离流行株进行全基因组测序,利用MegAlign 7.1.0软件确定分离株的ptxP、ptxA、prn、fim3基因型,并与我国无细胞百日咳疫苗株CS株以及NCBI数据库中公开的其他国家和地区流行的百日咳博德特氏菌ptxP、ptxA、prn、fim3抗原基因特征进行对比分析;使用RAxML软件基于对28株百日咳博德特氏菌全基因组SNP构建系统发育树。结果云南西双版纳4株百日咳临床分离株BP-L1、BP-L2、BP-L3、BP-L4基因组比CS株多产生了33~36个插入序列引起的基因重排。4株百日咳临床分离流行株的ptxP、ptxA、prn、fim3基因序列与CS株相似度在99.2%~100%。系统发育树结果显示,CS株与参考株TohamaⅠ聚为1支,形成独立进化分支;近年来全球流行的百日咳博德特氏菌分成2个聚类,BP-L1、BP-L4与多数欧美国家百日咳博德特氏菌聚为1支,主要为ptxP3/ptxA1/prn2型菌株,BP-L2、BP-L3与亚洲国家和地区的流行的百日咳博德特氏菌聚为1支,主要是ptxP1/ptxA1/prn1型菌株。结论云南西双版纳临床分离株与疫苗株相比,主要毒力蛋白基因和进化分支发生了明显变化,与近年来国际流行的百日咳博德特氏菌遗传进化一致。

去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素纯化液中内毒素TritonX-114液相分离法的建立及其效果评价

目的建立去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)纯化液中内毒素的TritonX-114液相分离法,并评价其效果。方法以影响TritonX-114液相分离法效果的TritonX-114加入量、4℃混匀时间、37℃分层时间、25℃16743×g离心时间为试验因素,每个因素设计3个水平,通过正交试验设计12组试验。每组试验获得的样品均检测蛋白回收率,以蛋白回收率最高的条件为最佳。采用最佳条件去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素,检测FHA蛋白含量、内毒素含量及TritonX-114残留量。结果TritonX-114液相分离法最佳条件:TritonX-114加入量为1%,4℃混匀时间为30 min,37℃分层时间为60 min,25℃16743×g离心时间为10 min。最佳条件下去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素后,内毒素含量均<0.25 EU/mL,TritonX-114残留量均值为0.183%,蛋白回收率均值为91.04%。结论TritonX-114液相分离法能够有效去除无细胞百日咳疫苗FHA纯化液中的内毒素,且方法耗时短,操作简便。

运用细胞培养／链特异性逆转录聚合酶链式反应法进行甲肝灭活疫苗的灭活验证试验

目的建立一种快速灵敏特异的甲肝灭活疫苗的灭活验证方法。方法运用细胞培养／链特异性逆转录聚合酶链式反应对甲肝灭活疫苗进行灭活验证，并与传统的ELISA法及巢式RT-PCR检测甲肝全RNA进行比较。结果细胞培养／链特异性逆转录聚合酶链式反应法对甲肝灭活疫苗进行灭活验证，结果全为阴性，与传统的ELISA法结果相同。而采用巢式RT-PCR检测甲肝全RNA的方法对甲肝灭活疫苗进行灭活验证，则出现一些假阳性结果。结论细胞培养，链特异性逆转录聚合酶链式反应法是一种简便、快速、灵敏的甲肝灭活疫苗的灭活验证方法。大大缩短了检测周期，用于疫苗的常规检测有较好前景。

DTacP-sIPV或DTacP-IPV/Hib基础免疫大鼠后加强免疫百白破联合疫苗Tdap的体液免疫评价

目的观察组分无细胞百白破-Sabin株脊髓灰质炎联合疫苗(DTacP-sIPV)或无细胞百白破-灭活脊髓灰质炎-b型流感嗜血杆菌联合疫苗(DTacP-IPV/Hib)基础免疫大鼠后加强免疫破伤风类毒素、降低抗原含量的白喉毒素和无细胞百日咳联合疫苗(Tdap)是否产生免疫加强效果,为候选青少年及成人Tdap疫苗提供临床前研究参考。方法将自主研发的DTacP-sIPV和已上市的DTacP-IPV/Hib按0、1、2月3剂免疫程序分别免疫Wistar大鼠,检测免疫前和每剂次免疫后各组大鼠血清中各组分抗体水平。基础免疫完成10个月后,用候选Tdap加强免疫1次,并检测加强免疫前和免疫1个月、6个月后血清中各组分抗体水平。结果3剂次基础免疫1个月后,DTacP-sIPV组抗白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、抗破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、抗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、抗丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和抗百日咳黏附素(pertactin,PRN)抗体的几何平均滴度(GMT,Log2)分别为17.41、18.34、18.11、19.93、13.91,血清阳转率均达到100%;基础免疫10个月后,抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.17、14.26、13.60、14.51、10.39,血清阳转率维持在89%以上。Tdap加强免疫1个月后,DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA抗体的GMT分别为16.49和17.26、16.80和17.63、16.70和17.74、18.48和19.26,血清阳转率均达到100%,组间差异无统计学意义(P均>0.05);抗PRN抗体的GMT分别为13.07和11.00,血清阳转率为100%和88%,DTacP-sIPV组高于DTacP-IPV/Hib组(P<0.05)。Tdap加强免疫6个月后,DTacP-sIPV组和DTacP-IPV/Hib组抗DT、抗TT、抗PT、抗FHA和抗PRN抗体的GMT分别下降至15.74和14.87、15.07和15.14、14.84和15.73、16.62和16.37、11.44和9.96,血清阳转率维持在88%以上。结论候选疫苗Tdap在基础免疫接种DTacP-sIPV和DTacP-IPV/Hib的Wistar大鼠模型加强免疫中可诱导产生良好的体液免疫应答,但抗体滴度随时间推移而衰减。