KANSL1蛋白的真核表达纯化及功能验证

目的利用昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)表达KANSL1蛋白并进行纯化,同时验证该蛋白在体外对微管蛋白聚合的影响。方法构建真核表达载体pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒(Bacmid),用脂质体转染介导Bacmid进入草地贪夜蛾细胞(Sf9 cell),以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。随后用此重组杆状病毒感染并扩增Sf9细胞使其大量表达His-mCherry-KANSL1融合蛋白。通过镍柱亲和层析对表达的His-mCherry-KANSL1融合蛋白进行初步纯化,再经快速蛋白液相色谱(FPLC)进一步纯化,利用Western印迹、考马斯亮蓝染色鉴定目的蛋白的表达纯化效果,最后通过体外微管聚合实验分析纯化的KANSL1蛋白对微管蛋白聚合的影响。结果质粒测序显示,pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒构建成功;考马斯亮蓝染色、Western印迹表明纯化得到正确的His-mCherry-KANSL1蛋白,体外微管聚合实验显示KANSL1蛋白显著促进微管蛋白的聚合。结论成功构建pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒并在真核表达系统中表达和纯化,重组KANSL1蛋白具有促进微管聚合的作用,为后续KANSL1蛋白功能研究奠定了基础。

基于Cre-LoxP系统的线粒体钙离子单向转运体脑条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定

目的 应用Cre-LoxP系统构建线粒体钙离子单向转运体(MCU)脑条件性敲除小鼠。方法 采用胚胎干细胞(ES细胞)打靶技术,将两个LoxP位点转入MCU基因5号外显子两端,构建MCU^(flox/+)小鼠。经与Nestin-cre工具小鼠交配获得MCU脑条件性敲除小鼠(MCU^(flox/+):Nestin-cre^(+))。采用鼠尾PCR进行基因型鉴定,Western印迹和实时荧光定量PCR(qPCR)技术分别从蛋白质和mRNA水平检测MCU的敲除效果。统计分析敲除小鼠生长发育和繁殖情况,旷场实验评价敲除小鼠自发活动性和适应性,高架O迷宫评价敲除小鼠焦虑情绪。结果 基因型鉴定、Western印迹和qPCR结果显示MCU脑条件性敲除小鼠成功构建,敲除小鼠繁殖能力正常,子代雌雄和基因型比例符合预期。与野生型小鼠相比,MCU脑条件性敲除小鼠体重明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。敲除小鼠在旷场中运动的总距离和运动时间明显高于野生型小鼠(P<0.05),在中间区域的停留时间、高架O迷宫开放臂的进入次数和时间无显著性差异。结论 成功构建MCU脑条件性敲除小鼠,小鼠可正常生长繁育,发育略有迟缓,运动和适应能力正常,有高度活跃行为,无明显焦虑样情绪。