2种猪冠状病毒双重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种可同时检测2种猪冠状病毒即猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的双重RT-PCR检测方法并进行临床应用。【方法】对TGEV和PEDV的单项RT-PCR方法分别进行条件优化后对2种病毒的双重RT-PCR进行条件优化并进行特异性与敏感性试验,然后用单项RT-PCR方法和双重RT-PCR对临床样品进行比较检测。【结果】双重RT-PCR检测方法的PEDV与TGEV的检测敏感度分别为59、49copies/μL,该方法对当前常见猪源RNA病毒的检测结果都为阴性。该方法对2013—2016年18个猪场的235份仔猪腹泻样品的检测结果显示,PEDV和TGEV的个体阳性率分别为73.6%和2.1%,与单项RTPCR方法检测结果无显著性(P>0.05)差异,临床样品中PEDV的猪场阳性率与个体阳性率都极显著(P<0.01)高于TGEV。【结论】建立了一种有较高灵敏性与特异性的PEDV与TGEV的双重RT-PCR检测方法,近年来猪传染性腹泻样品中PEDV检出率极显著高于TGEV。

猪圆环病毒2型与3型双重PCR检测方法的建立

【目的】建立针对猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的一种双重PCR检测方法。【方法】先优化猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的单独PCR检测方法条件,在此基础上优化这2种猪圆环病毒的双重PCR检测方法条件,之后进行其特异性与灵敏度的检测,并进行初步临床应用检测。【结果】建立的猪圆环病毒2型与猪圆环病毒3型双重PCR检测方法对猪圆环病毒1型、猪细小病毒、伪狂犬病病毒等当前常见猪源DNA病毒的检测结果都是阴性,检测猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的灵敏度分别是610、800 copies/μL。该方法对120份仔猪样品的检测结果显示,猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检出率分别为56.7%和38.3%,虽然稍低于各自单独PCR检出率;但并没有显著差异(P>0.05),且与单独PCR检测方法的符合率都达到95%以上。【结论】建立了一种特异性强、敏感性高的猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型双重PCR检测方法,为区分猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型提供了一种快速检测方法。

桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型抗病毒效果初探

【目的】通过对某猪场采集的组织样本进行猪圆环病毒2型分离鉴定及培养,探讨桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型抗病毒效果。【方法】将从某猪场采集的疑似猪圆环病毒2型阳性病料经无菌处理后接种于猪肾细胞进行病毒的分离培养,PCR方法鉴定,细胞体外培养分离株病毒并分析其生长特性,然后通过桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液处理病毒侵染的细胞,荧光定量PCR方法测定细胞内病毒载量。【结果】分离培养出猪圆环病毒2型分离株BY-F6代与GenBank中已收录的猪圆环病毒2型ORF2序列同源性可达到99.47%~99.60%;该病毒可在猪肾细胞中进行体外培养,48 h为病毒的复制高峰期,TCID_(50)为10^(-4.3)/0.1 mL。6.25 mg/mL的桂枝复方水煎液体外对猪圆环病毒2型具有显著的预防作用(P<0.05)及极显著的治疗作用(P<0.01),3.13 mg/mL的桂枝复方水煎液可显著降低细胞内猪圆环病毒2型的复制(P<0.05),桂枝复方水煎液不具有体外直接杀灭猪圆环病毒2型的能力。5.00 mg/mL的大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型具有显著的预防作用(P<0.05)及极显著的杀灭作用(P<0.01),2.50 mg/mL的大黄复方水煎液可直接参与杀灭猪圆环病毒2型,显著降低细胞内该病毒的载量(P<0.05),大黄复方水煎液体外对猪圆环病毒2型感染后的治疗作用不佳。【结论】桂枝复方水煎液和大黄复方水煎液体外对从某猪场分离及鉴定的猪圆环病毒2型具有一定的抑制作用。

凝结芽孢杆菌对肉鸡免疫功能的影响

【目的】探讨凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)对肉鸡免疫功能的影响。【方法】取健康3日龄肉鸡随机分空白对照组(基础日粮),抗生素组(基础日粮加杆菌肽),BC低剂量组(基础日粮加凝结芽孢杆菌活菌数为2×107 CFU/mL)、BC中剂量组(基础日粮加凝结芽孢杆菌活菌数为2×108 CFU/mL)、BC高剂量组(基础日粮加凝结芽孢杆菌活菌数为2×109 CFU/mL)。试验期35 d,试验结束肉鸡称量体质量、采血、剖检,分析免疫器官指数、血液T淋巴细胞转化、血液生化指标、测定IL-10和IgG含量。【结果】试验期第14天之后抗生素组与BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡平均日增体质量显著提高,且随着试验期延长BC中剂量组肉鸡日增体质量最明显;试验期BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡法氏囊指数均高于抗生素组,试验期14~28 d时BC中剂量组肉鸡脾脏指数均显著高于空白对照组,试验期7~28 d时BC中剂量组胸腺指数显著高于空白对照组;试验期14~35 d时BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡血液T淋巴细胞转化率显著提高,明显高于空白对照组和抗生素组,2×108 CFU/mL凝结芽孢杆菌促进T淋巴细胞转化显著;试验期第14天时BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡血清IL-10和IgG含量较高;试验期间BC低剂量组、BC中剂量组、BC高剂量组肉鸡生理生化指标与对照组差异不显著。【结论】凝结芽孢杆菌能增强T淋巴细胞转化,促进细胞因子分泌及免疫抗体产生,提高免疫器官指数,其中以凝结芽孢杆菌为2×108 CFU/mL时提高机体免疫功能效果最显著且优于杆菌肽。

凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡生长及肠道形态结构的影响

[目的]通过分析平均日采食量、料重比、屠宰指数、肠道绒毛高度/隐窝深度比值,探究凝结芽孢杆菌BC-HYI对肉鸡生长性能及肠道形态结构的影响。[方法]选取3日龄健康、体质量110~140 g的肉鸡75只,随机分为对照组(基础日粮);抗生素组(基础日粮加杆菌肽);凝结芽孢杆菌低剂量组(基础日粮加凝结芽孢杆菌BC-HYI,细菌数2×10^(7) CFU/mL);凝结芽孢杆菌中剂量组(基础日粮加凝结芽孢杆菌BC-HYI,细菌数2×10^(8) CFU/mL);凝结芽孢杆菌高剂量组(基础日粮加凝结芽孢杆菌BC-HYI,细菌数2×10^(9) CFU/mL)。试验期为35 d,每7 d为一个周期对试验肉鸡称量体质量、采血和剖检。[结果]凝结芽孢杆菌低剂量组、凝结芽孢杆菌中剂量组可以显著提高肉鸡生长性能与屠宰指数;凝结芽孢杆菌中剂量组、凝结芽孢杆菌高剂量组提高十二指肠绒毛高度/隐窝深度比值作用的效果显著且持久;凝结芽孢杆菌中剂量组促进乳酸菌的生长,抑制大肠杆菌的生长效果更优。[结论]2×10^(8) CFU/mL凝结芽孢杆菌BC-HYI可以改善肠道形态结构,调节盲肠内乳酸菌和大肠杆菌的生长;对肉鸡具有显著促生长作用。

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】利用SYBR Green I荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法。【方法】根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证。【结果】建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应。检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×10^(1) copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403%。【结论】成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测。

蛴螬肽提取物对铅致小鼠肾中毒的解毒保护作用机制研究

目的本实验通过构建醋酸铅致小鼠肾中毒模型,探讨蛴螬肽提取物对小鼠的解毒保护作用机制,为机体铅性肾病的防治提供试验依据。方法随机取小鼠分为对照组、模型组、阳性药组以及不同剂量蛴螬肽组(80、160、320 mg/kg),除对照组外所有组小鼠隔天腹腔注射醋酸铅20 mg/kg,连续15 d。此时对照组和模型组小鼠同时灌服生理盐水而阳性药组小鼠灌服二巯基丁二酸(DMSA 70 mg/kg)混悬液,蛴螬肽组小鼠灌服不同剂量蛴螬肽提取物,每天1次连续15 d,采用HE染色显微镜观察肾组织状态;检测肾功能指标(BUN、Cr)和肾组织中抗氧化酶水平(SOD、GSH-Px)及过氧化物(MDA)含量;RT-PCR、Western Blot技术检测分析Ⅱ相解毒酶(NQO1)、抗氧化酶(HO-1)和信号分子(Nrf2)基因和蛋白表达水平。结果蛴螬肽组与模型组小鼠相比,体重增加但低于对照组,肾组织形态显著改善,血清中BUN、Cr水平显著降低(P<0.05),肾组织中抗氧化酶(SOD、GSH-Px)水平显著提高(P<0.05),MDA含量显著减少,Ⅱ相解毒酶基因(NQO1)、抗氧化酶(HO-1)及信号分子(Nrf2)mRNA及蛋白表达水平均显著上调(P<0.01)。结论蛴螬肽提取物激活Nrf2-ARE信号通路,增强铅中毒小鼠的抗氧化功能和提高解毒酶基因表达而发挥其解毒保护作用。

二乙烯亚胺在猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株灭活疫苗中的应用

[目的]通过甲醛和二乙烯亚胺对猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株的灭活效果比较,获得一种适合猪流行性腹泻病毒疫苗灭活的生产工艺。[方法]将二乙烯亚胺接种小白鼠观察二乙烯亚胺的毒性。分别使用甲醛和二乙烯亚胺,在室温条件下灭活PEDV-WN株病毒液8、12、16、20和24 h,取灭活后的病毒液接种生长良好的单层Vero细胞,进行灭活效果的检验;同时,取灭活检验合格的病毒液进行无菌检验。灭活合格的病毒液乳化配苗,进行安全性和效力试验。[结果]接种二乙烯亚胺的小白鼠28 d均健活,状态良好;甲醛体积分数为0.3%,灭活16 h可使病毒液完全灭活;二乙烯亚胺浓度为0.010 mol/L,灭活12 h可使病毒液完全灭活;灭活合格的病毒液无菌;将不同方法灭活后的病毒液乳化配苗,接种3~5日龄的仔猪,安全性较好,未观察到不良反应,然后用PEDV-WN毒株攻毒,二乙烯亚胺灭活制备的疫苗比甲醛灭活制备的疫苗保护率高。[结论]在猪流行性腹泻病毒PEDV-WN株病毒液中加入浓度为0.010 mol/L的二乙烯亚胺,在室温灭活12 h,可使病毒完全灭活,且制备的疫苗安全性好,保护率高。