目的:检测卵巢肿瘤(ovarian tumor,OTU)结构域线性链接特异性去泛素化酶(OTU domain deubiquitinase with linear linkage specificity,OTULIN)在胃癌组织中的表达情况,并探讨敲除OTULIN基因表达对胃癌MKN45和AGS细胞增殖的影响,及可能...目的:检测卵巢肿瘤(ovarian tumor,OTU)结构域线性链接特异性去泛素化酶(OTU domain deubiquitinase with linear linkage specificity,OTULIN)在胃癌组织中的表达情况,并探讨敲除OTULIN基因表达对胃癌MKN45和AGS细胞增殖的影响,及可能的作用机制。方法:采用免疫组织化学法检测73例胃癌组织与24例正常胃黏膜组织中OTULIN的表达水平,分析OTULIN表达与胃癌临床病理特征和患者预后的相关性。收集并分析癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus database,GEO)中的胃癌数据验证上述结论。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除OTULIN表达的胃癌MKN45和AGS细胞并用蛋白质印迹法检测基因敲除效率;采用CCK-8法和软琼脂克隆检测敲除OTULIN表达对MKN45和AGS细胞增殖的影响。蛋白免疫沉淀-质谱技术筛选OTULIN和线性泛素分子(INT-Ub.7KR)的共同互作蛋白,发现线性泛素化修饰底物蛋白。利用丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性试剂盒检测敲除OTULIN表达后糖酵解限速酶的活性变化,乳酸定量试剂盒检测乳酸生成情况。最后采用免疫共沉淀及蛋白质印迹法验证OTULIN对底物蛋白线性泛素化作用。结果:免疫组织化学法检测结果显示,OTULIN在胃癌组织中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织(P=0.0041),肿瘤组织中OTULIN高表达者生存期较短(P=0.0077)。TCGA和GEO数据库数据分析也显示胃癌组织OTULIN表达水平升高(P<0.05),且OTULIN高表达与患者不良预后相关(P=0.011)。统计结果显示,OTULIN高表达与TNM分期晚密切相关(P=0.0273),预测患者较短生存期(P=0.04)。敲除OTULIN基因可显著抑制胃癌细胞的增殖能力(P均<0.001),降低胃癌细胞中PK活性和乳酸生成水平(P均<0.01)。OTULIN可结合糖酵解途径的多个限速酶并下调它们的线性泛素化水平,包括丙酮酸激酶M1(pyruvate kinase M1,PKM1)和PKM2以及乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)和LDHB。结论:胃癌中OTULIN高表达可能是评估患者预后的一个新的生物标志物,OTULIN可能通过下调糖酵解限速酶的线性泛素化修饰,激活胃癌糖酵解途径,促进胃癌发展。展开更多
文摘目的:检测卵巢肿瘤(ovarian tumor,OTU)结构域线性链接特异性去泛素化酶(OTU domain deubiquitinase with linear linkage specificity,OTULIN)在胃癌组织中的表达情况,并探讨敲除OTULIN基因表达对胃癌MKN45和AGS细胞增殖的影响,及可能的作用机制。方法:采用免疫组织化学法检测73例胃癌组织与24例正常胃黏膜组织中OTULIN的表达水平,分析OTULIN表达与胃癌临床病理特征和患者预后的相关性。收集并分析癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus database,GEO)中的胃癌数据验证上述结论。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除OTULIN表达的胃癌MKN45和AGS细胞并用蛋白质印迹法检测基因敲除效率;采用CCK-8法和软琼脂克隆检测敲除OTULIN表达对MKN45和AGS细胞增殖的影响。蛋白免疫沉淀-质谱技术筛选OTULIN和线性泛素分子(INT-Ub.7KR)的共同互作蛋白,发现线性泛素化修饰底物蛋白。利用丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性试剂盒检测敲除OTULIN表达后糖酵解限速酶的活性变化,乳酸定量试剂盒检测乳酸生成情况。最后采用免疫共沉淀及蛋白质印迹法验证OTULIN对底物蛋白线性泛素化作用。结果:免疫组织化学法检测结果显示,OTULIN在胃癌组织中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织(P=0.0041),肿瘤组织中OTULIN高表达者生存期较短(P=0.0077)。TCGA和GEO数据库数据分析也显示胃癌组织OTULIN表达水平升高(P<0.05),且OTULIN高表达与患者不良预后相关(P=0.011)。统计结果显示,OTULIN高表达与TNM分期晚密切相关(P=0.0273),预测患者较短生存期(P=0.04)。敲除OTULIN基因可显著抑制胃癌细胞的增殖能力(P均<0.001),降低胃癌细胞中PK活性和乳酸生成水平(P均<0.01)。OTULIN可结合糖酵解途径的多个限速酶并下调它们的线性泛素化水平,包括丙酮酸激酶M1(pyruvate kinase M1,PKM1)和PKM2以及乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)和LDHB。结论:胃癌中OTULIN高表达可能是评估患者预后的一个新的生物标志物,OTULIN可能通过下调糖酵解限速酶的线性泛素化修饰,激活胃癌糖酵解途径,促进胃癌发展。