郑州地区犬细小病毒VP2基因遗传进化分析

为了解郑州地区犬细小病毒(CPV)的流行特征及遗传变异情况,采集81份2017—2022年郑州市疑似感染CPV犬的粪便或肛门拭子进行PCR检测。随机挑选出21份经PCR检测的CPV阳性样本,扩增其VP2基因,连接至载体并测序,用MegAlign软件对流行株进行同源性和氨基酸变异分析,并通过MEGA6.0软件构建基因遗传进化树。结果显示:2017—2018年郑州地区CPV流行基因型为New CPV-2a亚型,2019—2022年则以CPV-2c亚型为主导。21株CPV流行株与疫苗株的核苷酸同源性为98.3%~99.0%,其中CPV-79流行株与疫苗株的核苷酸同源性最低,仅为98.3%,且该毒株在VP2蛋白GH环区出现多位点氨基酸突变;部分CPV-2c亚型流行株第5和370位氨基酸出现A到G和Q到R的变异。研究结果表明:郑州地区当前流行基因型为CPV-2c亚型,虽出现多位点氨基酸突变,但未形成明显的国内进化分支。值得注意的是,New CPV-2a亚型在进化过程中形成了不同分支且存在抗原突变的风险。本研究丰富了郑州地区CPV的分子流行病学调查数据,也为我国CPV流行疫苗株的研制奠定了基础。

共免疫对跳蚤叮咬引起的猫过敏性皮炎保护效果评价

为评价共免疫r FSA1和p VAX-FSA1对于猫跳蚤过敏性皮炎(FAD)的预防免疫保护效果,用人工合成的跳蚤唾液抗原(FSA1)基因,分别构建原核表达质粒p ET28a-FSA1和真核表达质粒p VAX1-FSA1。p ET28a-FSA1转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达纯化FSA1,获得r FSA1。12月龄以上猫共免疫r FSA1+p VAX-FSA1,第14天实施二免后,进行跳蚤叮咬,连续4轮,跳蚤叮咬结束后,统计皮炎评分。结果显示,第4轮攻跳蚤后共免疫r FSA1+p VAX-FSA1组的猫皮炎评分远远低于FAD对照组,说明共免疫r FSA1+p VAX-FSA1能抑制FAD症状,对跳蚤叮咬猫引起的过敏性皮炎有显著保护效果,可以作为预防猫跳蚤过敏性皮炎的良好办法。

表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5的构建及鉴定

【目的】采用AdEasy系统构建能表达传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)VP2蛋白的重组复制缺陷型人5型腺病毒(Human adenovirus serotype-5,HAdV-5),以期为IBDV活载体疫苗的研发提供新的思路。【方法】通过同源重组将VP2基因克隆至穿梭质粒pAdTrack-GOI构建重组穿梭质粒pAdTrack-VP2;PmeⅠ酶线性化pAdTrack-VP2后热击转化大肠杆菌BJ5183-AD-1感受态细胞,利用菌内同源重组构建重组腺病毒质粒pAd-VP2;将pAd-VP2经PacⅠ酶线性化和纯化后转染HEK293A细胞,包装表达VP2蛋白的重组复制缺陷型HAdV-5 (rAd5-VP2),将鉴定正确的重组病毒感染非复制型细胞(Vero、CEF和DF1细胞)并分析目的蛋白的表达情况。【结果】将rAd5-VP2通过HEK293A细胞扩大培养,测得第10代病毒的滴度为7.9×10~9 IFU/mL;RT-PCR结果显示,VP2基因在重组腺病毒中能稳定翻译;Western blotting和间接免疫荧光试验均检测到VP2蛋白的表达,蛋白分子质量为41 ku;将rAd5-VP2感染Vero、CEF和DF1细胞也检测到VP2蛋白的表达,表明HAdV-5有作为IBDV活载体疫苗研发的可能性。【结论】本研究构建了重组复制缺陷型HAdV-5,该毒株能感染部分哺乳动物细胞和家禽细胞并能检测到目的蛋白的表达。

马立克病病毒1型LZ1309株的分离鉴定与生物特性分析

从免疫马立克病(MD)HVT和CVI988疫苗的甘肃某规模化鸡场采集MD阳性病鸡抗凝全血,分离淋巴细胞,接种于鸡胚成纤维细胞,分离出1株马立克病病毒(MDV)。病毒蚀斑纯化后经PCR和间接免疫荧光鉴定,该毒株为MDV1型毒株,命名为LZ1309株。PCR扩增并测序致瘤基因meq。核苷酸同源性分析结果显示,与国内分离株LS株的同源性最高(99.9%),与CVI988株的同源性最低(98.8%)。氨基酸序列分析显示,氨基酸突变位点符合国内强毒株的特征。为掌握LZ1309株的致病力,进行了LZ1309株攻毒试验。结果显示,LZ1309株攻毒组鸡的死亡率为13.3%,攻毒组鸡体重显著降低,肝、脾、腺胃乳头和心脏均出现肿瘤结节,胸腺和法氏囊严重萎缩。PCR检测攻毒鸡的器官组织,均能扩增到MDV1型强毒株meq基因的特异性条带。本研究成功分离鉴定出1株MDV强毒株,此结果为研究国内MDV毒力演化、致病机理和疫苗研发奠定了重要基础。

鸡Akirin2基因对传染性法氏囊病病毒VP2 DNA疫苗免疫反应的影响

为了探讨鸡Akirin2基因对传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2 DNA疫苗诱导的免疫反应的影响,将同时表达VP2蛋白和Akirin2蛋白的重组质粒免疫14日龄SPF鸡,14 d后加强免疫,最后以IBDV BC6-85强毒攻击。结果显示,Akirin2基因能够增强VP2 DNA疫苗诱导的特异性免疫反应,提高外周血淋巴细胞的增殖能力,影响细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-9、IL-10、IL-17和IL-18的表达水平。与单独免疫表达Akirin2蛋白或VP2蛋白的重组质粒对上述细胞因子表达的影响有一定差异。

广西玉林地区MDV强毒YL2002株的分离鉴定

广西玉林地区鸡马立克氏病(MD)疫苗免疫鸡群出现MD疫情,笔者从出现MD疫情的规模化肉鸡养殖场采集抗凝血,分离得到MDV野毒株,鉴定为血清Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV),命名为YL2002。与15株参考毒株进行比对,meq基因核苷酸同源性分析结果显示,YL2002株与JS201801株MDV同源性最高,为100%;与648A株同源性最低,为98.6%。将分离得到的MDV野毒株回归动物实验,分析其对肉鸡品种黄鸡2号的致病性,该分离株攻毒组发病鸡出现瘫痪症状,并发现心脏、肝肿瘤。病理组织学观察可见各组织出现淋巴细胞增生和浸润。致病性结果显示,YL2002攻毒组发病率和死亡率为100%和69.2%。本试验成功分离得到1株MDV强毒株,为广西玉林地区频发的马立克氏病疫情的防控提供了理论基础,也为我国MDV的毒力演化研究提供了参考。