结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的 构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。 方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a(+ ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。 结果 从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。 结论 利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。

四种外排泵抑制剂逆转阴沟肠杆菌耐药性效果比较

目的比较四种外排泵抑制剂碳氰间氯苯腙(CCCP)、利血平﹑维拉帕米﹑奥美拉唑逆转阴沟肠杆菌耐药性的效果。方法收集多重耐药阴沟肠杆菌36株,采用E-test方法检测头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星、氨曲南对菌株的最低抑菌浓度(MIC),再分别检测加入CCCP、利血平﹑维拉帕米﹑奥美拉唑后菌株对抗菌药物的MIC,加入外排泵抑制剂后,MIC下降4倍或以上者判断为外排阳性。结果加入外排泵抑制剂后,筛选外排阳性株阳性率由高到低依次为CCCP 34.72%、利血平13.89%、奥美拉唑9.72%、维拉帕米5.56%;环丙沙星加入CCCP后外排阳性株数量最多,阳性率为58.33%。结论四种外排泵抑制剂均可不同程度地逆转阴沟肠杆菌的耐药性,CCCP逆转阴沟肠杆菌的耐药性效果最佳。

阴沟肠杆菌AcrAB-TolC外排系统基因研究

目的研究临床分离的阴沟肠杆菌AcrAB-TolC外排系统基因的携带情况及其与抗菌药物耐药性的关系。方法对临床分离的141株阴沟肠杆菌用MicroScanWalkAway40全自动细菌分析仪进行鉴定和药敏试验;聚合酶链式反应(PCR)检测AcrAB-TolC外排系统acrA,acrB,tolC和acrR 4种基因在阴沟肠杆菌中的分布,并对PCR产物进行纯化、克隆、测序。结果 acrA,acrB,tolC和acrR 4种基因在141株阴沟肠杆菌中的检出率分别为98.5%、51.06%、82.27%、78.72%,且4种基因检出率有显著性差异(P<0.01);acrA基因和acrB基因在不同组的阳性率有显著性差异(P<0.01),各耐药组高于敏感组,且多重耐药组阳性率最高;acrR基因和tolC基因在不同组的阳性率无显著性差异。结论我院分离的阴沟肠杆菌高水平携带AcrAB-TolC外排系统基因,且与抗菌药物耐药性具有相关性。

鱼体肝吸虫囊蚴对芥辣的耐受研究

目的建立肝吸虫感染的宿主动物模型,并评价青芥辣杀伤囊蚴的效果。方法解剖人工感染的鲤鱼,检查鲤鱼肝吸虫囊蚴感染情况,同时将调味品青芥辣配制成1g/ml、2g/ml和3g/ml浓度,采用自然浸杀法浸泡囊蚴。结果共剖杀10尾感染后鲤鱼,9尾查获肝吸虫囊蚴,感染率为90%。1g/ml,2g/ml和3g/ml的芥辣浓度组作用30see内均未见囊内蚴体发生变化;作用10min时2g/ml,3g/ml浓度组囊蚴发生变形;作用30min时三种浓度组囊蚴均发生变形,其中3g/ml浓度组处理的蚴体萎缩成不透光残体。结论调味品青芥辣对鱼体内的肝吸虫囊蚴有抑制和杀死作用,但在短时间内作用较弱。

结核病疫苗的研究进展

由于全球结核病疫情呈上升趋势,而现今唯一使用的结核病疫苗—卡介苗存在许多不足之处。因此,迫切需要开发新型疫苗用以防治结核病。本文从基因工程重组活疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗、营养缺陷型疫苗等方面介绍了目前新型结核病疫苗的研究进展。

人鼻咽癌CNE-2细胞转染方法的比较研究

目的比较三种非病毒载体转染方法转染人鼻咽CNE-2细胞。方法分别采用脂质体转染法、电穿孔转染法、磷酸钙纳米颗粒转染法将pEGFP-N1质粒DNA转染人鼻咽癌CNE-2细胞,转染24 h后荧光显微镜观察EGFP的表达,计算转染率;MTT实验比较各转染方法对CNE-2细胞的细胞毒性。结果脂质体转染组的转染率为(51.9±2.8)%;电穿孔转染组的转染率为(42.8±2.6)%;磷酸钙纳米颗粒转染组的转染率为(48.1±2.3)%。经统计学分析,三种方法转染CNE-2细胞的转染率相互之间有显著的差异(P<0.001);MTT结果显示,磷酸钙纳米颗粒转染法的细胞毒性最小。结论磷酸钙纳米颗粒转染法转染效率相对较高,而细胞毒性小,可作为转染CNE-2细胞的首选转染方法。

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的重组表达质粒,并对其表达产物进行纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pET-23a(+),构建pET-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3);PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pET-esat-6,SDS-PAGE显示表达产物分子量约为6kD,经亲和纯化后的ESAT-6重组蛋白纯度高,且能被结核病人血清所识别.利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT-6重组蛋白,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础.……

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化.用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白.PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别.成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白.……

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在Vero E6细胞中的表达

构建结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的真核表达质粒,并研究其在Vero E6细胞中的表达情况.采用PCR方法自结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增esat-6基因片段,定向亚克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-esat-6重组质粒;利用脂质体介导的转染技术,将其导入Vero E6细胞,RT-PCR法检测mRNA表达情况,Western-blot法鉴定表达产物.从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出esat-6基因片段,成功构建重组表达质粒pVAC-esat-6;转染esat-6基因的Vero E6细胞,RT-PCR检测可见一条约288bp的目的条带,表达产物经Western-blot鉴定,其相对分子质量约为6000,能被结核病人血清所识别.构建的真核表达质粒pVAC-esat-6能在Vero E6细胞中表达,为结核病核酸疫苗的进一步研究打下基础.……

近5年铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的耐药变迁研究

目的了解该院近5年来临床常见的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌耐药性的动态变化情况以及在不同标本间的差异。方法采用回顾性分析方法,对2007年10月至2012年9月临床分离的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌对21种抗菌药物的耐药情况进行统计分析。结果铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的临床分离株数量呈逐年上升的趋势。抗菌药物的耐药率均处于下降的趋势,而且有的抗菌药物耐药率下降变化差异有统计学意义(P<0.05);部分抗菌药物的耐药性出现波动性变化。从痰标本和血标本分离的铜绿假单胞菌的耐药率差异无统计学意义(P>0.05),而大肠埃希菌却有6种抗菌药物的耐药率比较差异有统计学意义(P<0.05)。从血标本和尿标本分离的铜绿假单胞菌,左氧氟沙星和环丙沙星的耐药率差异有统计学意义(P<0.05),大肠埃希菌对头孢他啶、头孢噻肟和亚胺培南的耐药率差异有统计学意义(P<0.05),其他抗菌药物的耐药率比较差异无统计学意义(P>0.05)。从呼吸内科和ICU痰标本分离的铜绿假单胞菌的耐药率差异有统计学意义(P<0.01),而大肠埃希菌有12种抗菌药物的耐药率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论抗菌药物的耐药率均处于下降的趋势,说明抗菌药物使用的控制措施出现了成效;铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的耐药情况因来自不同标本和不同科室发生不同的变化,对指导临床用药有重要意义。

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的 构建原核重组表达质粒pET2 3a SAG2 ,并在大肠埃希菌中实现高效表达 ,以及检测表达产物的抗原性。 方法 PCR扩增SAG2编码基因目的片段 ,琼脂糖凝胶电泳回收纯化 ,克隆至 pMD18 T载体 ,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体 pET2 3a ,构建重组表达质粒 pET2 3a SAG2 ,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆 ,经限制性酶切分析鉴定后 ,转化大肠埃希菌BL2 1(DE3 ) ,以异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。 结果 PCR扩增出约 5 0 0bp的SAG2编码基因目的片段 ,与预期片段大小相符 ,经测序鉴定无基因突变 ;所构建的 pET2 3a SAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定 ,与预期结果一致 ;含有pET2 3a SAG2重组质粒的大肠埃希菌BL2 1(DE3 )诱导后得到了高效表达 ,SDS PAGE显示表达产物约Mr 190 0 0 ;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。 结论 成功构建了pET2 3a SAG2表达质粒 ,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达 ;表达产物具有良好的抗原性。

从临床案例中研究临床与微生物检验相互沟通的重要性

通过分析北京大学深圳医院微生物检验专业最近一年与临床沟通的案例,采用病例介绍和案例分析,研究临床与微生物检验相互沟通的重要性。通过临床与微生物检验相互沟通,微生物检验人员针对特殊病例特殊标本,改进检验流程,找到临床久治不愈的疑难感染病例的真正病原微生物:分枝杆菌、毛霉和放线菌;临床及时修订治疗方案,避免了误诊误治及延误病情。因此,加强临床与微生物检验相互沟通,开拓微生物检验人员的检验思维,发扬医务人员锲而不舍的专业精神,对临床疑难感染病的治疗成功有着重要的意义。

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究

目的用pVACGRA4真核表达重组质粒免疫小鼠,观察诱导的免疫应答及对弓形虫感染的保护作用。方法大量制备pVACGRA4真核表达重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠3次,以pVAC空质粒及不经任何处理的空白组为对照。于末次免疫4周后作免疫指标测定(包括MTT法测定小鼠脾脏T淋巴细胞增殖活性、间接免疫荧光法测定T淋巴细胞亚群数目、双夹心ELISA法测定细胞因子IFNγ及IL4含量、间接ELISA法测定IgG抗体滴度),并观察攻毒试验后小鼠存活情况。结果脾淋巴细胞增殖各组间差异无显著性(P>0.05);pVACGRA4组CD4+T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD8+T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD4+/CD8+比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫组IFNγA值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4组可诱导产生特异性IgG抗体,但滴度不高;pVACGRA4免疫组小鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论用pVACGRA4重组质粒DNA免疫小鼠,可诱导产生以细胞免疫为主的免疫应答及对弓形虫攻击感染的部分保护作用。

弓形虫GRA4基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达质粒,并研究其在体外与体内细胞中的表达情况。方法采用PCR方法及克隆技术,构建pVACGRA4重组质粒;利用脂质体介导转染法,将该重组质粒导入HEK293细胞,用RTPCR法及Westernblot法检测其表达情况;利用基因枪导入法将该重组质粒导入BALB/c小鼠体内细胞,测定免疫鼠T淋巴细胞亚群及IFNγ、IL4含量,并观察攻毒试验后小鼠存活情况,以评价其免疫保护力。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段,成功构建重组表达质粒pVACGRA4;转染GRA4的HEK293细胞,RTPCR检测可见一条约987bp的目的条带,表达产物经Westernblot鉴定,其分子量约为41kD,能被特异性免疫血清所识别;经pVACGRA4免疫后的小鼠,其CD+4T细胞百分率无明显变化(P>0.05),CD+8T细胞百分率明显增加(与pVAC对照组比较P<0.05,与空白对照组比较P<0.01),CD+4/CD+8比值也较空白对照组明显降低(P<0.01);pVACGRA4免疫鼠IFNγ的A值比对照组略高,但差异无显著性(P>0.05),IL4A值各组间无明显变化(P>0.05);pVACGRA4免疫鼠存活率显著高于两对照组,死亡小鼠的平均存活时间延长(与空白对照组比较P<0.05)。结论构建的真核表达质粒pVACGRA4能在HEK293细胞中和小鼠体内细胞中表达,为弓形虫疫苗的进一步研究打下基础。

弓形虫致密颗粒蛋白4的原核细胞表达与纯化

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)的pET原核细胞表达系统,并对其表达产物进行纯化及其免疫学活性测定。方法利用PCR扩增弓形虫GRA4基因片段,定向亚克隆入原核细胞表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌(E.coliBL21 DE3),以组氨酸结合柱亲和层析法纯化表达产物,并对其进行抗原活性分析。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,用ELISA检测其特异性抗体滴度。结果成功构建了弓形虫pET-GRA4原核细胞表达系统,其表达产物相对分子质量(Mr)约为40 000,主要以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白能被人工感染弓形虫RH株速殖子的兔血清识别。免疫小鼠后可诱导产生高滴度的特异性IgG抗体。结论利用pET原核细胞表达系统成功表达和纯化了弓形虫GRA4重组蛋白,该蛋白具有一定的免疫学活性。

SARS冠状病毒S蛋白DNA疫苗的构建及其免疫效果研究

目的构建SARS冠状病毒棘突糖蛋白(S蛋白)的两个片段S1和S2的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,检测它们在哺乳动物细胞中的表达,并观察它们在小鼠中诱导的体液和细胞免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒棘突糖蛋白的两个片段S1和S2的基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-S1和pVAC-S2重组质粒。并通过Lipofectamine 2000将它们转染到HEK293细胞,RT-PCR和Western-blot鉴定重组质粒在真核细胞中的转录和表达。以构建的重组质粒直接免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体以及抗体亚类,流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建了重组真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2,并可在HEK293细胞中获得表达。免疫小鼠三次后,抗体滴度达到了1∶3 200。pVAC-S1诱导了高滴度的IgG2a,IgG2b和IgG1,pVAC-S2刺激产生高滴度IgG2a,IgG2b和较高滴度的IgG3。脾脏T淋巴细胞亚群分析示pVAC-S1和pVAC-S2两免疫组小鼠CD3+和CD8+T细胞明显升高。结论构建的真核表达质粒pVAC-S1和pVAC-S2能在哺乳动物细胞中表达,免疫小鼠后诱导了明显的细胞和体液免疫应答。

162例次腹膜透析相关性腹膜炎病原学分析

目的研究该院腹膜透析相关性腹膜炎透出液的病原菌培养鉴定结果、涂片革兰染色镜检结果、耐药情况,为腹膜透析相关性腹膜炎的临床诊断、治疗、预后及实验室检查提供数据支持。方法回顾性分析2014年1月至2019年4月该院收治的124例腹膜透析相关性腹膜炎患者共162次透出液的病原菌分布、涂片革兰染色镜检结果、耐药情况。结果 162例次透出液检测中,115例次透出液培养阳性,阳性率71.0%。培养出126株病原菌,其中83株革兰阳性球菌(65.9%),34株革兰阴性杆菌(27.0%),6株真菌(4.8%),2株革兰阴性球菌,1株革兰阳性杆菌。115例次透出液培养阳性的腹膜炎患者中有78例次同步送检涂片革兰染色,其中34例次阳性,阳性率43.6%。在病原菌耐药性方面,48.0%葡萄球菌耐苯唑西林,4.8%链球菌耐青霉素,54.5%肠杆菌目细菌耐第3、4代头孢菌素。结论在该院,腹膜透析相关性腹膜炎病原菌以革兰阳性球菌为主;在透析相关性腹膜炎诊治中,应重视透出液涂片革兰染色镜检;应根据病原菌监测情况进行经验性抗菌药物的选择。

弓形虫有效抗原表位的筛选及其对小鼠免疫保护性的研究

目的 利用噬菌体随机肽库技术筛选弓形虫抗原的有效表位 ,并探讨其免疫保护效果。 方法 用纯化的弓形虫免疫兔血清IgG对噬菌体 12肽库进行三轮筛选 ,对获得的日的噬菌体用间接ELISA和Dot -ELISA检测其特异性 ,并对其中的某些克隆进行Western -blot分析和序列测定 ;用混和噬菌体克隆及强阳性表位克隆免疫BABL/c小鼠 ,间接ELISA法测定其特异性抗体滴度 ,攻击感染后观察小鼠存活情况。 结果 经三轮筛选 ,特异性噬菌体得到富集 ,随机挑取 18个克隆经间接ELISA和Dot-ELISA鉴定 ,有 16个克隆能与弓形虫免疫兔血清lgG呈特异性反应。Western -blot分析显示P2克隆能被免抗弓形虫血清所识别 ,具有类似于弓形虫抗原的免疫原性 ,其序列为 5’ -CTTCAGTTGGATCGGGCTCCGTTTTGGAATCAGGGT -3’ ,与GenBank的弓形虫已知序列无一级结构的同源性 ;与原肽库对照组相比 ,P2实验组和P总实验组免疫小鼠均能诱导出较高滴度的IgG抗体 ,抗攻击感染后小鼠的存活率及存活时间也均高于对照组。 结论 利用噬菌体随机肽库技术获得了弓形虫抗原的有效模拟表位 ,这些表位能诱导对弓形虫的部分保护作用。

SARS病毒N蛋白真核表达质粒构建及诱导的体液免疫

目的构建SARS病毒核衣壳蛋白(N)的真核表达质粒,并研究其在小鼠体内诱导的体液免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS病毒N蛋白基因片段,定向克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-N重组质粒;大量制备该重组质粒,经基因枪腹部皮内注射免疫BALB/c小鼠三次,间接ELISA法测定免疫鼠IgG抗体效价。结果成功构建了重组表达质粒pVAC-N,免疫小鼠后可诱导产生出特异性的IgG抗体。结论构建的真核表达质粒pVAC-N能诱导小鼠产生特异性抗体,为SARS疫苗的进一步研究打下基础。