当归苯丙氨酸解氨酶基因片段克隆和组织特异性表达分析

苯丙氨酸解氨酶(PAL)在高等植物苯丙烷类代谢中具有重要作用,与植物体内很多重要的次生代谢产物的合成密切相关。当归主要药效成分阿魏酸是苯丙烷类代谢途径中的产物之一。为了探究阿魏酸生物合成和积累的机理,本研究克隆了当归苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)部分序列,运用荧光定量PCR方法分析该基因在当归不同组织部位的表达差异。根据已经克隆的植物PAL保守序列设计一对扩增引物,以当归叶片总RNA为模板,采用反转录PCR(RT-PCR)方法扩增出PAL片段并连接到pGEM-T Easy载体上,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经PCR检测后测序,得到一段706bp的序列(登录号:KJ000258),内含终止密码子TAA,编码232个氨基酸,与GenBank中注册的伞形科植物珊瑚菜等6个物种的PAL核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性都在80%以上;运用SYBR Green荧光定量PCR方法,以当归肌动蛋白基因Actin为内参基因,检测PAL在当归不同组织中的表达量,结果显示PAL在叶片中表达量最高,其次是茎和根,叶片和茎中表达量分别是根中表达量的7.5和2.7倍。

复方红藤颗粒的药效学研究

目的观察复方红藤颗粒(红藤、大黄、金银花,等)对小鼠肠蠕动以及镇痛的影响,进一步观察对大鼠溃疡性结肠炎的治疗作用以及对大鼠发热体温的影响。方法碳末推进实验和湿粪计数实验考察肠蠕动影响;醋酸扭体法考察对小鼠的镇痛作用;观察复方红藤颗粒对三硝基苯磺酸诱导的溃疡性结肠炎大鼠损伤组织的修复作用;干酵母实验观察其对发热大鼠体温的降温作用。结果湿粪计数、炭末排出时间结果显示复方红藤颗粒低、中、高剂量组与正常组、乳果糖对照组比较有显著差异性,且不同剂量间比较也有一定差异性;镇痛实验结果显示,复方红藤颗粒低、中、高剂量组与模型组比较小鼠扭体次数均有显著性差异;抗炎实验结果显示,各治疗组溃疡减少,黏膜充血、水肿、炎症细胞浸润程度减轻,伴轻度肉芽组织增生,且高剂量组明显优于模型组;干酵母实验结果显示复方红藤颗粒能使大鼠的体温降低。结论复方红藤颗粒对小鼠有一定的镇痛作用,使小鼠肠蠕动功能增强。并能够降低发热大鼠的体温,对大鼠溃疡性结肠炎有较好的治疗作用。

适宜当归实时荧光定量分析的总RNA提取方法研究

为了有效消除次生物质、多糖和多酚类物质的严重干扰,获得高质量适宜于实时荧光定量分析的当归总RNA,本研究采用CTAB法、试剂盒法和Trizol法分别提取当归根、茎、叶组织的总RNA,并通过紫外可见光分光光度计、非变性琼脂糖凝胶电泳和反转录荧光定量PCR检测总RNA的纯度、产率、完整性及质量。结果表明:CTAB法提取的当归根、茎、叶组织总RNA纯度较高、完整性较好且叶组织总RNA得率较高;试剂盒法所提的总RNA完整性亦较好,但纯度略差且各组织的得率均较低;Trizol法提取的茎组织总RNA能满足荧光定量PCR要求,但提取的根和叶组织总RNA均出现严重污染,无法满足后续研究要求。因此,CTAB法是一种经济、可靠、适宜当归实时荧光定量分析的总RNA提取方法。本研究结果为今后有效开展当归分子生物学研究奠定了方法学基础,也为其他药用植物总RNA的提取提供了参考。

钾素营养水平对当归光合生理的影响

目的:研究钾素营养水平对当归光合特性及荧光参数的影响,为制定当归规范化生产中合理施用钾肥技术提供理论依据。方法:通过大田栽培试验研究不同施肥方式下,施K_2O量150 kg·hm^(-2)(K_(150))、300 kg·hm^(-2)(K_(300))和450 kg·hm^(-2)(K_(450))等钾素营养水平对当归成药期净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)、胞间CO_2浓度(Ci)、水分利用率(WUE)、表观CO_2利用效率(CUE)等光合指标及最小初始荧光(F_0)、光化学量子效率(F_v/F_m)、光化学淬灭系数(qP)、电子传递速率(ETR)、PSⅡ反应中心的激发能捕获效率(F_(v')/F_(m'))、PSⅡ反应中心电荷分离实际量子效率(ΦPSII)等叶绿素荧光参数的影响。结果:无论是全部基施,还是基施50%+叶盛期追施50%,随钾素营养水平的提高,当归叶片的Pn、Gs、Tr、WUE、CUE、F_v/F_m、qP、ETR、F_(v')/F_(m')、ΦPSII、叶绿素含量都有所提高,最适钾素营养水平为K_2O 300 kg·hm^(-2)。结论:钾素营养对当归叶片的光合作用和叶绿素荧光特性有不同程度地影响,适宜的钾素营养水平有利于改善当归叶片光合生理特性,促进初生代谢产物的合成与积累。

当归DXR基因保守区克隆和组织特异性表达分析

目的克隆当归Angelica sinensis 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)编码基因部分保守区序列,分析DXR基因在当归根、茎、叶中的特异性表达。方法根据已克隆的植物DXR保守序列设计一对简并引物,以当归叶片总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增出DXR片段并连接到pGEM-T Easy载体上,转化大肠杆菌菌株Escherichia coli DH5α,阳性克隆经PCR检测后测序。运用RT-qPCR方法,以当归肌动蛋白基因Actin为内参基因,检测DXR在当归不同组织中的表达量。结果得到一段564 bp的DXR基因序列,并在GenBank注册(登录号:KJ000259)。序列分析表明,该片段编码187个氨基酸,与GenBank中注册的海岛棉Gossypium barbadense等6个物种的DXR核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均在80%以上;DXR在叶中表达量最高,相对表达量分别是茎和根组织中的2.5倍和3.2倍(P<0.01)。结论本研究首次从当归中克隆出了DXR部分保守区序列,并揭示了DXR在不同组织中的差异表达,为有效利用该基因奠定前期工作基础。

当归咖啡酸-O-甲基转移酶基因克隆和序列分析

目的克隆当归Angelica sinensis咖啡酸-O-甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferases,COMT)编码基因全长c DNA,并对序列进行生物信息学分析。方法提取当归叶片总RNA为c DNA合成模板,利用同源克隆结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归COMT全长c DNA,并利用NCBI、Ex PASy网站上的Blast N、Blast P、ORF Finder、Compute PI/Mw、Prot Scale、PROSITE、SWISS-MODEL等序列在线分析工具和MEGA、DNAMAN生物信息学软件对序列进行分析。结果获得COMT全长c DNA序列,并在Gen Bank注册(登录号KP188587)。序列分析表明,克隆的c DNA全长为1 436 bp,其中包括5’-UTR(76 bp)和3’-UTR(362 bp),含有1个1 098 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码365个氨基酸的多肽链;预测蛋白质相对分子质量为40 230,理论等电点(p I)为5.43;无信号肽,具有典型的II型氧甲基转移酶结构域SAM_OMT_II。结论首次克隆当归COMT基因全长c DNA,为当归COMT基因功能研究和当归阿魏酸生物合成与调控的机制研究奠定基础。

当归4-香豆酸辅酶A连接酶基因克隆与组织表达分析

4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate coenzyme A ligase,4CL)为高等植物苯丙烷代谢途径关键酶之一,在当归阿魏酸的生物合成中起调控作用。研究利用同源克隆结合c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆当归4CL编码基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析4CL基因在当归幼苗生长过程中根、茎、叶组织中的表达特征。结果表明,获得的4CL c DNA序列(在Gen Bank已注册,登录号为KT880508)全长1 815 bp,含有1个1 632 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码544个氨基酸的多肽链。4CL基因在当归幼苗不同生长阶段的根、茎、叶组织中均有表达,随着苗龄增大,茎、叶中的相对表达量显著增加(P<0.05),而根中表达量变化不大,表明4CL基因在当归幼苗中的表达具有明显的时空性。该研究为进一步研究4CL基因的结构与功能,解析当归阿魏酸的合成代谢机制和时空调控的分子基础奠定了工作基础。