日本医蛭摄食前后不同组织中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式

【目的】探究日本医蛭在不同摄食阶段、各个组织(唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢)中水蛭素基因(hirudin)的时空表达模式,为水蛭药材的科学合理利用提供理论依据。【方法】基于水蛭唾液腺转录组数据筛选结果及基因克隆获得的水蛭素基因序列信息,利用实时荧光定量PCR方法,对水蛭关键活性成分的编码基因hirudin在不同摄食阶段、不同组织中的表达量进行检测分析,研究该基因的时空表达模式。【结果】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤及精/卵巢组织中均有表达,且在唾液腺中的表达量显著高于其他组织;Hirudin基因在不同摄食阶段的唾液腺组织中表达结果显示,摄食后第2天表达量显著升高,之后随着摄食时间的推延而呈下降趋势;Hirudin基因在嗉囊、肠中的表达量呈先升高后下降趋势,分别于摄食后第1、第2天达到最高,之后会随着停食时间延长呈下降趋势,尤其是在摄食后第7、第8天的表达量呈显著性降低;Hirudin基因在皮肤组织中也有表达,并随着停食时间的延长呈先升后降趋势,最高峰出现在摄食后第2天;在精/卵巢组织中,摄食期间hirudin基因的表达量最高,与其他摄食阶段的表达呈显著性差异。【结论】水蛭素基因(hirudin)在日本医蛭的唾液腺、肠、嗉囊、皮肤和精/卵巢组织中均有不同程度的表达,在唾液腺中的表达量显著高于其他组织。摄食行为及食物刺激可能影响水蛭素基因(hirudin)的表达,在不同摄食阶段的表达量存在显著差异。研究结果可为水蛭药材的科学采收加工、提取部位的科学选取、合理入药提供理论依据和技术支撑,对未来水蛭药材资源的可持续利用具有重要的参考价值。

小金蝠蛾幼虫血细胞对病原真菌的免疫防御研究

[目的]研究小金蝠蛾幼虫血细胞对不同病原菌侵染的细胞免疫响应差异,揭示拟棒束孢病害发生和冬虫夏草菌形成机理的细胞免疫差异。[方法]利用光学显微镜观察小金蝠蛾幼虫感染病原菌后血细胞的数量、形态变化、细胞免疫反应和黑化反应,以L-多巴为底物,采用分光光度法测定感染不同时间后的血淋巴中酚氧化酶活性。[结果]小金蝠蛾幼虫感染冬虫夏草菌的生存曲线无显著差异,血细胞对冬虫夏草菌无明显的集结、包囊、黑化等免疫作用,酚氧化酶活性侵染初期出现降低,然后逐渐恢复至健康幼虫水平;小金蝠蛾幼虫感染粉棒束孢的生存曲线具有显著差异,对感染早期血细胞具有明显的集结、包囊、黑化等免疫响应,酚氧化酶活性初期降低后逐渐升高。[结论]小金蝠蛾幼虫血细胞对病原真菌冬虫夏草菌和粉棒束孢免疫防御响应策略具有显著差异,血细胞对冬虫夏草菌无明显的免疫反应,对粉棒束孢虽然有强烈的免疫反应,但是不能阻止粉棒束孢的快速萌发而导致幼虫短期内死亡。

冬虫夏草产区土壤特征和微生物组成分析

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis是我国珍稀濒危药材,具有严格的分布区域,而特定的生态系统更是冬虫夏草资源生长条件苛刻的重要因素。本研究采集11个冬虫夏草主产区的土样,测定土壤理化性质与菌群结构及其对冬虫夏草产量的影响并对关键因子进行验证。结果表明:(1)各产区土壤N、P、K、pH、EC和H_(2)O等参数差异不显著,土壤微生物群落中以酸杆菌门Acidobacteria(28.6%~36.5%)、变形菌门Proteobacteria(21.5%~32.2%)为主要优势菌门,且土壤氮元素含量与变形菌门和硝化菌门Nitrospirae的菌群丰度正相关(0.665和0.668)。(2)对影响虫草产量的关键因子拆分,己科河菌门Rokubacteria及酸杆菌门分别提供了0.2620和0.0986的贡献度。(3)通过对己科河菌门菌群功能分析,合成抗生素是其核心功能,功能表达丰度最高可达28%。(4)进一步对富含己科河菌门的土样中含有的病原菌鉴定,被孢霉属Mortierella链格孢属Alternaria等丰度分别降低了0.054和0.002,踏查样区(25 m×25 m)内虫草产量也可达到31根。综上,冬虫夏草产区之间的生境参数虽然具有相似性,但在富含己科河菌门的土壤中,病原菌种类及丰度呈现下降趋势,推测对虫草产出有重要贡献。

饥饿及恢复喂食对日本医蛭肠道菌群多样性的影响

为了研究饥饿及恢复喂食对日本医蛭肠道微生物菌群的影响,采用高通量测序技术分析了正常组、饥饿30d、恢复喂食7d以及恢复喂食14d的日本医蛭肠道微生物菌群特征及多样性的变化。结果显示:日本医蛭核心菌群门水平上,主要集中于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes),属水平核心菌群有气单胞菌属(Aeromonas)、Mucinivorans属、拟杆菌属(Bacteroides)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)等。饥饿及恢复摄食,对气单胞菌属、Mucinivorans属在内的核心菌群多样性及丰度产生了一定的影响。本研究为揭示日本医蛭肠道菌群组成以及研究日本医蛭消化道微生物功能奠定了基础。

日本医蛭抗凝活性研究

目的:研究分析人工养殖条件下日本医蛭活体、干品的抗凝活性,为日本医蛭合理入药提供参考。方法:根据中国药典规定,采用凝血酶滴定法对不同处理的日本医蛭样品进行测试。结果:发现日本医蛭抗凝活性依次为超低温冻干品、鲜品、晒干品。结论:保证日本医蛭最佳抗凝活性的方法为超低温冻干。

环境因子对云南蝠蛾羽化的影响

为明确环境因子对云南蝠蛾蛹发育羽化的影响,采用三元一次正交组合设计分析方法,研究了不同土壤温度、土壤含水量、土层深度条件组合对云南蝠蛾蛹历期、羽化历期、羽化率、羽化出土率的影响,并分别建立了回归方程。结果表明,不同环境因子组合处理对云南蝠蛾蛹的发育羽化有显著影响,其中以土壤温度16℃、土壤含水量60%、土层深度5 cm组合条件下蛹历期最短,为18.41 d;羽化历期最短,为17 d;羽化最为集中;羽化率、羽化出土率结果最好,均达到了96.67%,在土壤温度8℃、土壤含水量30%、土层深度15 cm的组合条件下羽化率和羽化出土率均最低,均为33.33%;在土壤温度8℃、土壤含水量60%、土层深度5 cm的组合条件下蛹历期最长,为36.75 d。从回归分析来看,土壤温度对蛹的发育羽化起着主导主用,特别是对蛹历期、羽化历期、羽化率的影响,在这三个回归方程中,其偏回归系数绝对值最高,分别16.2、9.70、5.94;土壤含水量对羽化出土率的影响起着主导作用,其偏回归系数最高为75.42,对羽化率的影响仅次于土壤温度,而对蛹历期、羽化历期影响较小;土层深度对蛹历期、羽化出土率的影响分别次于土壤温度、土壤含水量,其偏回归系数绝对值分别为0.46、7.92,对羽化历期和羽化率的影响最小。

冬虫夏草培殖中粉棒束孢病害动态变化规律

【目的】本文探索了高海拔地区冬虫夏草培殖过程中寄主蝙蝠蛾幼虫粉棒束孢病害在土壤中的动态变化规律。【方法】本研究以分离的粉棒束孢为研究对象,模拟野外自然条件和室内人工饲养条件下蝙蝠蛾幼虫感染粉棒束孢病原菌的情况,测定蝙蝠蛾幼虫僵虫体及其周围土壤中粉棒束孢的动态变化。【结果】在室内人工饲养环境下僵虫体上宿存量随着感染粉棒束孢孢子量先逐渐增加,巅峰可达到16.48×10^9个,随后缓慢下降,3个月后仍保持在109水平,致死率保持在80%以上,周围土壤中的粉棒束孢含量先增加后缓慢下降,但是时间比僵虫体延后,致死率保持在50%以上;野外自然僵虫体上粉棒束孢含量增速比室内饲养环境缓慢,孢子量也是先逐渐积累,巅峰仅室内人工饲养环境的一半,随后快速下降,3个月后衰减了约90%,致死率低至50%以下,周围土壤粉棒束孢的含量缓慢增加后快速下降,致病率降至20%左右。【结论】野外高海拔自然环境不利于粉棒束孢的宿存和传播,室内饲养环境为粉棒束孢的宿存和传播里提供了有利条件,这可能是室内培殖容易爆发粉棒束孢病害的原因之一。

土壤微生态环境对冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫病原菌粉棒束孢宿存及毒力的影响研究

测定了温度、含水量、土壤微生物三个因素以探讨蝙蝠蛾幼虫生长过程中微生态环境对粉棒束孢(Isaria farinose)宿存及毒力的影响。结果表明粉棒束孢30℃保存6个月的宿存量降低至10^3个/g以下。随着保存温度降低,宿存量的下降速度变缓,粉棒束孢在-18℃保存1年后,宿存量仍基本维持在10^6个/g以上。粉棒束孢在低湿环境下(含水量<35%)保存1年的宿存量维持在10^4个/g,含水量45%~65%,粉棒束孢宿存量会先增加后降低,降低的速度基本随湿度的增加而增加,1年后宿存量降低至10^3个/g以下。土壤微生物对粉棒束孢的宿存具有明显抑制作用,野外高山草甸土壤中微生物显著抑制粉棒束孢萌发,不利于粉棒束孢的宿存,而室内饲养土壤由于幼虫排泄物、饲料腐殖质可能有利于粉棒束孢的宿存。上述研究结果为进一步制定粉棒束孢防治方法,同时也为粉棒束孢作为生防菌的有效保存提供了参考。

基于转录组的冬虫夏草菌微循环产孢研究

\为研究冬虫夏草菌(Ophiocordyceps sinensis)微循环产孢过程中的分子机理,采用高通量测序技术,对微循环产孢前后冬虫夏草菌的转录组进行研究。筛选获得差异表达基因6902个。Gene Ontology(GO)功能聚类分析表明,差异表达基因主要参与分子功能、胞内运输、核糖核蛋白复合体等生物学通路。京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析结果表明,差异表达基因参与了核糖体、嘧啶代谢、蛋白酶体、嘌呤代谢、甘氨酸代谢等过程。Mmc、Mcb、MaH1、MaPP5、MaAGA、Pyk等候选基因不同程度的参与了冬虫夏草菌微循环产孢过程,其中Mcb家族基因可能起到关键作用。通过qRT-PCR验证差异表达基因,定量结果与转录组测序结果一致。本研究为进一步揭示冬虫夏草菌微循环产孢分子机制以及关键基因的调控提供了重要信息。

纳米银溶胶介导的表面增强拉曼用于细菌的鉴定研究

运用表面增强拉曼散射(Surface enhanced Raman scattering,SERS)方法,实现两种大肠埃希菌和两种金黄色葡萄球菌间的高效检测与鉴别。最终为临床上细菌的鉴别与分类提供一种快速有效的鉴别方法。利用微波法制备了适合细菌SERS检测的纳米银溶胶,并以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin resistant Staphylococcus aurens,MRSA)为检测样本,优化了银溶胶与菌液的体积比、作用时间,得到最佳测试条件为银溶胶与菌液(麦氏浊度为0.5)体积比为1?2,作用时间为1 h,将其用于两种大肠埃希菌JM109、DH5α和两种金黄色葡萄球菌ATCC25923、MRSA的SERS检测,并对相应特征峰进行归属。分别选择了30例大肠埃希菌JM109、DH5α和30例金黄色葡萄球菌ATCC25923和MRSA作为样本训练集,6例大肠埃希菌JM109、DH5α和6例ATCC25923、MRSA为测试集,基于主成分分析法(PCA)联合线性判别法(LDA)模型,JM109、DH5α训练集分类正确率为93.33%,ATCC25923、MRSA训练集分类正确率为76.67%,盲测集分类正确率分别为91.67%、75%。结果表明,制备的银纳米溶胶作为增强介质测得的不同细菌的SERS图谱使用该判别模型时能较好地区分不同种类的细菌,而对于同种细菌的普通菌和耐药菌的鉴别效果相对较差。本研究为临床上细菌的快速准确鉴别与分类提供参考。

龟甲胶的现代研究进展

龟甲胶是我国名贵中药,具有滋阴、养血、止血的功效。目前,国内对龟甲胶的研究十分匮乏,该研究通过查阅近15年有关龟甲胶研究报道,从龟甲胶的化学成分、药理作用、临床、真伪鉴定及质量控制研究等方面进行综述。

小金蝠蛾幼虫β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP1基因的分子特征与生物信息学分析

[目的]探索冬虫夏草寄主昆虫小金蝠蛾幼虫的β-1,3-葡聚糖识别蛋白βGRP1基因的结构特征与进化关系。[方法]通过PCR法克隆获得小金蝠蛾幼虫βGRP1基因的编码序列,并采用Protparam、NetPhos 2.0 Server cDNA、MEGA等软件分析βGRP1蛋白的理化特征和进化分析。[结果]小金蝠蛾幼虫βGRP1基因编码序列1593 bp,推断可编码530氨基酸组成的蛋白,该蛋白为分泌型蛋白,含有20个氨基酸的信号肽,包含2个功能结构域,该结构域与葡聚糖的识别密切相关;同源分析和分子系统进化树分析表明,鳞翅目昆虫中的βGRPs基因家族分为4个进化分枝,其中小金蝙蝠蛾与勾蝠蛾为单独的一个进化分枝,小金蝠蛾幼虫βGRP1进化较钩蝠蛾早,介于I型和Ⅲ型分支。[结论]该蛋白具有识别β-1,3-葡聚糖的结构域,并可能通过丝氨酸磷酸化激活酚酶源级联系统,启动免疫,为进一步探索βGRP1蛋白的免疫功能奠定基础。

温度、碳氮源对竹黄菌丝生长特性的影响

为明确温度、碳源、氮源对竹黄菌丝体生长的影响,通过设计5个温度处理、5种碳源、5种有机氮源及4种无机氮源,试验比较不同培养条件下竹黄菌丝体萌发、菌落特征、菌丝长势及颜色等特征差异。结果:菌丝体培养的最适温度为25℃,最佳碳源为淀粉和乳糖,最佳氮源为蛋白胨。

贡嘎钩蝠蛾交配及生殖力的研究

为明确交配时长、性比、密度及温度对贡嘎钩蝠蛾Thitarodes gonggaensis交配、产卵、孵化的影响,研究了不同交配时长、不同性比、不同成虫密度、不同交配温度对成虫交配、生殖力的影响。结果表明,成虫正常交配时长差异较大,交配时长为22-270 min,平均交配时长为90.85 min,均能够完成正常的产卵,平均孵化率达90.83%以上,人为干预交配时长对成虫产卵量没有影响,但对交配40 min以内处理的孵化率显著低于正常交配处理,因此,在繁殖虫种过程中,交配时长不足40 min以内的成虫避免人为干扰交配,导致成虫分开,以保证交配顺利完成;通过控制性比发现,雌雄蛾性比对产卵量无显著影响,但偏雄性组的交配率和孵化率均显著高于性比大于1.25∶1的偏雌性组,在人工饲养过程中,如果雄虫多余雌虫的情况下,交配性比建议维持在1∶1至1∶1.5之间,如果雄虫不足,则可以将已交过的雄虫放回交配箱与未交的雌虫继续交配;成虫密度对产卵量、孵化率没有显著影响,对交配率有一定的影响,密度过高会导致交配率下降;交配温度对成虫的交配时长、产卵量、孵化率均有显著影响,温度≤15℃处理交配成虫后其交配时长、产卵量、孵化率均显著高于温度20℃以上处理,最佳的交配温度维持在10℃条件下,交配时长最长,产卵量、孵化率最高。

日本医蛭早期发育阶段的生长性能与生长模型分析

[目的]研究日本医蛭的生长性能及生长发育规律。[方法]对人工繁育的日本医蛭摄食习性及生长性能进行了分析,并利用Logistic、Gompetz、Von Bertallanffy 3种非线性生长模型对日本医蛭体重生长情况进行曲线拟合。[结果]日本医蛭的特定生长率随生长时间的延长而逐渐下降,幼蛭孵化后4 d喂食,生长率达到最高(10.99%/d),日本医蛭的体重随着投喂次数、日龄、摄食量的增加呈现上升趋势。3种生长曲线模型均能较好地拟合日本医蛭的生长曲线,其中以Gompertz曲线的拟合度最好(R2=0.999)。[结论]曲线模型对日本医蛭生长曲线的拟合和分析是可行的。通过生长曲线的拟合分析可及时掌握日本医蛭的生长发育规律,发现饲养管理中存在的问题。

宽体金线蛭生殖系统形态结构与胚胎发育

宽体金线蛭是一种被广泛人工养殖的药用动物,其繁殖力的提高有利于增加养殖者的经济效益,取宽体金线蛭种蛭在室内养殖于自制的水蛭水族箱,取材进行解剖和石蜡切片,观察其生殖系统的形态结构.在宽体金线蛭产下卵茧后,观察其胚胎发育的主要阶段.实验结果表明:(1)宽体金线蛭是雌、雄同体的动物,其雄性生殖系统包括精巢、输精管、贮精囊、射精球、前列腺、阴茎鞘和雄孔几部分,雌性生殖系统包括卵巢、输卵管、蛋白腺、阴道囊和雌孔几部分;(2)宽体金线蛭卵茧产下约3h,受精卵进入二细胞期,约8h进入4细胞期,约12h进入8细胞期,约1d进入多细胞期,约3d进入囊胚期,约5d进入原肠胚期,约28d孵出幼蛭.

药用水蛭及其代用品的人工养殖进展

药用水蛭包括日本医蛭、宽体金线蛭和尖细金线蛭,是中国药典明确记载并收录的传统中药材,菲牛蛭作为药用水蛭代用品应用也较为广泛。查阅其人工养殖等方面的文献并对文献进行整理,发现国外学者的研究主要是对其活性成分的化学结构、药理、药效、药代动力学、毒副作用及临床试验等方面进行的;国内学者除这些外还对人工养殖方面进行了研究。随着相关研究的深入,药用水蛭及其代用品在生物医药领域的应用愈加广泛,因此对其需求量也在不断增加。但由于其生存环境的破坏,人工捕获增多,使其野生资源逐年减少,已不能满足市场的需求,因此药用水蛭及其代用品的人工养殖工作十分重要。

蚕丝生丝和熟丝在大鼠皮下降解的实验研究

目的:通过大鼠皮下埋植实验,从组织学角度探讨蚕丝(生丝和熟丝)在体内的降解。方法:将生丝和熟丝在SD大鼠皮下进行埋植,在第7、14、56、84、129、145天取材进行冰冻切片,分别进行H.E染色和DAPI、β-actin和CollagenⅠ免疫荧光染色观察。结果:在大鼠皮下埋植一定时间后,蚕丝的外表均被结缔组织包裹而在皮下形成包块。包块的直径在生丝和熟丝手术组间的差异无统计学意义(P>0.05)。在皮下埋植第7天观察到了蚕丝被降解的现象,在皮下埋植第145天仍然能够观察到大量未被降解的蚕丝。结论:蚕丝在体内的降解不是一个匀速的过程,其降解进程与细胞的动员有关,成纤维细胞参与此过程并分泌胶原蛋白。

温度骤变对日本医蛭肠道菌群的影响

目的研究急性温度应激条件下日本医蛭肠道微生物菌群多样性的组成及变化。方法选取健康日本医蛭200尾,设置对照组与试验组(各100尾),对照组25℃水体温度饲养、试验1组养殖水体温度急剧降温(30℃→4℃)、试验2组养殖水体温度急剧升温(4℃→25℃)。采用高通量测序技术分别研究对照组和试验组的日本医蛭肠道菌群特征及多样性变化。结果门分类水平上,日本医蛭肠道核心主导菌群为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes);属分类水平上,温度急剧变化后,气单胞菌属(Aeromonas)丰度显著增加,Mucinivorans丰度显著减少,脱硫弧菌属(Desulfovibrio)丰度减少。结论温度骤变对日本医蛭肠道主导菌多样性组成及丰度产生了一定的影响,有害致病菌增加,有益菌减少,从而最终导致水蛭出现病态及死亡现象。本研究对于指导人工养殖实践、日本医蛭药材资源可持续利用以及深入开展肠道微生物分子调控机制研究都具有重要的理论和实践意义。

蚕丝的结构与体外降解性质

研究蚕丝的结构与降解性质,不但有利于蚕丝制品的保护,拓展其在生物医药领域的利用空间,还可以为文物的考古提供参考依据。为了探讨蚕丝的结构与降解性质,笔者用扫描电子显微镜和组织切片方法观察蚕茧、茧丝、生丝和熟丝的结构,研究生丝和熟丝分别在4种降解液里156 d中的降解性质。结果显示,生丝中丝胶含量为16.70%~25.00%。经156 d的体外降解,在去离子水、磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞培养基（DMEM）、含10%胎牛血清的DMEM中,生丝和熟丝的失重率依次分别为14%/11%、12.5%/12.9%、11.1%/14.3%、8.8%/11.6%。结果表明,蚕丝在水环境中能够被缓慢地降解,降解的实质是水解作用,酶的作用并不显著。避免与化学物质和空气的接触将更有利于丝织品文物的保护。本研究还展示了由丝蛋白到蚕茧和生丝的组装过程。