犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

犬圆环病毒(DogCV)是圆环病毒科新发现的圆环病毒,旨在建立犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法。试验用PCR方法克隆犬圆环病毒ORF2基因保守区域,构建标准阳性质粒pClon007-ORF2。以标准阳性质粒pClon007-ORF2为模板对荧光定量PCR反应体系进行优化。结果表明,所建立的方法 Ct值与标准品在4.67×10~9 copies/μL^4.67×10~3 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.998,斜率为-3.445。该方法检测灵敏度为4.67×10~1copies/μL。该方法对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型等犬常见病原的检测均无交叉反应;所有稀释度标准品模板均在83.35℃出现窄的特异性熔解峰。临床样品检测表明,所建立的实时荧光定量PCR对犬圆环病毒的阳性检测率为12.50%(4/32)。

猪细小病毒7型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立猪细小病毒7型(PPV7)的快速定量检测方法,本研究根据PPV7(KU563733.1)基因序列设计一对特异性引物,扩增155 bp的PPV7衣壳蛋白基因,构建重组质粒pClon007-PPV7,以其作为标准品建立了PPV7的SYBR GteenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在5.00×10~9拷贝/μL^5.00×10~3拷贝/μL范围内呈良好的线性关系。该方法对猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病毒、乙脑病毒、口蹄疫病毒常见病原的检测均无特异性扩增,仅PPV7出现特异性扩增;该方法检测灵敏度可达5.00×10~1拷贝/μL;批内和批间变异系数均低于1%,具有较高的重复性和稳定性。对临床样品的检测结果显示,所建立的荧光定量PCR阳性检测率为71.88%,比普通PCR法检测的阳性率提高了约4.55%。该研究方法的建立为PPV7提供了一种新的快速定量检测技术。

基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒可视化基因芯片与荧光基因芯片的建立

根据GenBank中收录的基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒E蛋白基因序列,设计及筛选针对2种病毒的寡核苷酸探针及引物,制备基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒可视化基因芯片与荧光基因芯片,对芯片的灵敏性、特异性进行了验证,并将可视化基因芯片、荧光基因芯片进行灵敏性比较.结果显示,制备的两种基因芯片都能检测到基孔肯雅病毒和辛德毕斯病毒特异性杂交信号.可视化基因芯片、荧光基因芯片检测两种病毒质粒的灵敏度达到9.1×103copies/mL,6.8×101copies/mL和9.1×104copies/mL,6.8×103copies/mL,与普通PCR比较差异显著.荧光基因芯片灵敏度是PCR方法的10倍,可视化基因芯片是荧光基因芯片灵敏度的100倍.模拟病毒检测过程特异性检验证明,可视化基因芯片都具有良好的特异性.本试验建立了基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒两种特异的可视化和荧光基因芯片检测方法,两种方法灵敏度高、特异性强,适用于基孔肯雅病毒与辛德毕斯病毒的流行病学调查和种特异性鉴定.

乙型脑炎病毒可视化分型基因芯片的制备

目的:制备乙型脑炎病毒(JEV)可视化分型基因芯片。方法:根据JEV的基因组序列,应用生物学软件设计JEV分型引物及探针,制备其可视化分型基因芯片;用生物素标记的引物PCR扩增目的片段,并与固定于玻片上的探针杂交,加入链霉亲和素标记的纳米金,银增强实现可视化;进行特异性、灵敏性及重复性试验。结果:探针特异地与相应的标记目的基因片段杂交,并在芯片上呈现较强的阳性杂交信号;2号探针能特异性检出JEV,3、4号探针可分别对Ⅰ型和Ⅲ型JEV进行分型;芯片对JEV质粒检测的灵敏度达105拷贝/mL;以蓝耳病病毒等5种病毒为对照,芯片只对JEV响应,具有特异性;制备的基因芯片具有批间、批内重复性。结论:制备的基因芯片具有高特异性、灵敏性及重复性,可以快速、准确、高通量地对JEV进行可视化分型检测。

动物营养学实验课程线上线下交互教学模式初探

动物营养学实验课程是动物科学专业学生的必修课,该课程对于提高学生理论知识的学习能力,掌握实验技能,培养团队合作意识,提升学生综合素质,培养应用型人才具有重要意义。本文针对动物营养学实验课程当前的教学情况、教学中存在的问题、提高课程教学效果的措施及该课程线上线下交互教学模式应用过程中可能面临的挑战进行论述,为动物科学专业实验教学课程的改革提供参考。

互联网+临床思维在兽医传染病学课程建设中的应用

近年来,随着非洲猪瘟等新发烈性传染病的出现,我国畜牧业生物安全意识不断提高,产业出现转型升级,给动物医学学生临床实践带来了一定困难。此外,部分偏远地区高校由于教学经费短缺也严重限制了动物医学专业学生兽医传染病学临床实践技能的提升。学生对相关专业知识难以做到融会贯通并灵活应用。我校兽医传染病学课程教师通过长期积累提出了一些可将丰富的线上资源应用于兽医传染病学课程建设以提高学生临床思维的方案,可为培养高素质临床实用性兽医人才搭建教学平台,也可为从事兽医传染病学课程教学的高校教师提供参考。

基于超新星学习通平台的动物营养学教学改革研究

在大数据时代的背景下,“线上教学+课堂讲授”的模式已经成为高校教学发展的大趋势,这种教学模式使课程化考核贯穿学习的始终,增加了学生获取知识的渠道,调动了学生学习的主观能动性和参与的积极性。为进一步提高教学质量,本文基于超新星学习通平台,以动物营养学为例,探讨该线上教学平台在动物营养学教学过程中,包括课前准备、课中及课后的应用及效果。对“线上教学+课堂讲授”的模式进行了初探,构建了完整的线上教学内容。

基于问题导向理念的“互联网+”混合式“兽医传染病学”教学模式探索

随着信息技术的快速发展,传统的“兽医传染病学”教学方式已经不能满足社会对该领域相关人才的知识储备需求。应对网络时代大趋势,该课程的教学方式也要作出相应的改革。“互联网+”混合式教学模式是本研究的主要内容。依托超星学习通平台,从课前预习、课中传授以及课后巩固等3个方面进行线上的内容建设。在课前预习和课后讨论中引入问题导向教学法(Problem-Based Learning,PBL)进行案例讨论,调动学生学习的积极性和参与度。同时,在教学内容中融入耕读文化教育和课程思政教育,培养学生学农爱农情怀,增强学生服务“三农”和农业农村现代化建设的使命感和责任感。

市政排水工程施工质量管理与控制

在当前的时代背景之下我国社会经济得到了快速发展,城市化进程日益加快。城市基础设施正在逐步完善过程当中,尤其是在排水工程建设过程当中获得了比较优异成绩。在城市发展的过程当中基础设施建设是十分重要的一个部分。排水工程直接关系到基础设施建设整体成效。针对市政工程项目建设实施过程之中普遍存在的积水问题需要引起重视。积水问题不仅会对于道路工程项目实施质量和实施效果造成重大的负面影响,也会直接阻碍和影响到城市交通稳定性和安全性。所以需要管理人士针对市政工程项目以及排水系统加强质量管控,提高城市基础设施建设水平,促使城市实现健康、稳定的发展。本篇文章主要是排水工程项目建设施工质量管理、控制的研究,以供相关专业人士进行参考和借鉴。

应用不同表达载体表达欧洲型PRRSV ORF5蛋白的研究

目的构建多种欧洲型PRRSV GP5蛋白原核表达载体,并比较其在大肠埃希菌中的表达效率。方法参考GenBank发表的欧洲型PRRSV LV株(GenBank登录号:M96262)ORF5序列,通过序列分析,设计合成ORF5全基因序列扩增引物及信号肽缺失引物。构建原核表达质粒pET-28a-GP5、pET-28a-gGP5、pET-22b-GP5、pET-22b-gGP5、pET-32a-GP5、pET-32a-gGP5、pGEX-4T-GP5、pGEX-4T-gGP5,经IPTG诱导后采用SDS-PAGE电泳分析GP5蛋白在各个原核表达载体的表达情况。结果 pET-28a-gGP5、pET-22b-gGP5、pET-32a-gGP5均没有高效的表达出缺失信号肽的GP5蛋白,缺少信号肽的GP5蛋白在pGEX-4T-1载体中高效表达,目的蛋白分子质量单位为42ku,与理论值相符。没有缺失信号肽的GP5蛋白在pET-28a-GP5、pET-22b-GP5、pET-32a-GP5、pGEX-4T-GP5,均未得到高效表达。结论本实验构建的重组原核表达载体pGEX-4T-gGP5能在大肠埃希菌中高效表达欧洲型PRRSV GP5蛋白,为进一步分析该蛋白的抗原性奠定了基础。

2015年广西地区PRRSV流行株ORF5和Nsp2基因分子流行病学调查

目的对广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2和ORF5基因进行分子流行病学调查。方法采集广西地区猪病料样品45份,PCR扩增PRRSV毒株Nsp2和ORF5基因并进行遗传进化分析。结果 RT-PCR检测PRRSV 7份猪病料阳性。7株病毒与VR-2332和LV株的同源性分别为83.5%88.7%和62.1%64.8%。遗传进化分析显示,7株病毒分属于两个亚群,3株属于亚群Ⅳ,4株属于亚群Ⅵ。Nsp2序列分析显示,6株病毒有高致病性PRRSV 1+29aa氨基酸的缺失特征,其中GXBB11-2015在此基础上出现了新的20个氨基酸缺失,缺失碱基数为150个碱基。结论高致病性PRRSV已成为广西地区优势毒株,病毒Nsp2基因新的碱基缺失是PRRSV变异的又一证据。

基孔肯雅病毒E1基因重组腺病毒的构建、鉴定及稳定性

构建表达基孔肯雅病毒E1蛋白的重组腺病毒，鉴定该重组腺病毒，并对该重组腺病毒的稳定性进行研究。本研究通过构建重组腺病毒穿梭质粒Ad5-EGFP—CHIKVE1，将质粒Ad5-EGFP—CHIKV—E1与腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞获得重组腺病毒rAd5EGFP—cHIKv—E1，并通过Westernblot与PCR方法鉴定E1基因表达的稳定性。PCR鉴定结果表明重组腺病毒可扩增1323bp大小的条带；经Westernblot鉴定重组腺病毒可表达大小为52000的E1蛋白。结果表明，重组腺病毒rAd5-EGFPCHIKVE1可以成功表达基孔肯雅病毒E1基因；提取第0，2，4，6，8，10，12，14，16代重组腺病毒基因组，经PCR鉴定证实重组腺病毒在16代内稳定性良好。成功构建出表达基孔肯雅病毒E1基因的重组腺病毒rAd5EGFP—CHIKV—E1，该病毒可以稳定表达，为研发基孔肯雅病毒疫苗奠定基础。

H3亚型流感重组腺病毒的纯化工艺研究

目的为了探索经济、高效的腺病毒的纯化工艺,采用阴离子交换层析和分子筛层析两步法对H3亚型流感重组腺病毒pacAd-H3-EHA-H1HA1new进行纯化,并评价纯化效果。方法利用7L生物反应器培养HEK-293细胞,用于对H3型流感重组腺病毒进行扩增;利用冻融的方法使病毒从细胞中释放,通过阴离子交换层析和分子筛层析法纯化病毒,用分光光度计检测纯化样品的纯度,并测定病毒的滴度和回收率。结果纯化后的样品经PCR鉴定正确,纯化前后的病毒滴度分别为5.6×10~9 TCID_(50)/ml和1.1×10^(10) TCID_(50)/ml,纯化后样品纯度(A260/A280值)分别为2.01和1.26,阴离子交换层析纯化的回收率为31.5%,分子筛层析纯化的回收率为81.4%,总回收率为25.6%。结论利用阴离子交换层析和分子筛层析两步法纯化H3亚型流感重组腺病毒的回收率和滴度高,该方法可用于重组腺病毒的纯化。

H3亚型流感重组腺病毒候选疫苗的构建及鉴定

目的研制一种制备工艺简单、无需鸡胚即可大量生产的预防季节性H3亚型流感重组腺病毒候选疫苗。方法构建含有外源H3HA基因的重组腺病毒穿梭载体质粒pacAd5-H3HA,并用酶切的方法进行鉴定;将鉴定阳性的pacAd5-H3HA与腺病毒骨架载体质粒线性化后用脂质体介导共转染HEK293细胞,分别采用RT-PCR、间接免疫荧光试验以及Western blot方法对构建的H3亚型流感重组腺病毒疫苗进行鉴定。结果 RT-PCR扩增出约1.8kb片段,与目的片段大小相同,表明外源基因H3HA成功插入重组腺病毒。间接免疫荧光试验显示重组腺病毒转染后的HEK293细胞中检测到特异性蛋白,Western blot显示在70ku处有一反应条带,表明该H3HA蛋白能被兔抗H3亚型HA蛋白血清识别。结论构建的H3亚型流感重组腺病毒能在HEK293细胞中表达具有反应原性的H3HA蛋白,为后续的动物实验奠定了基础。

金刚烷胺抑制乙脑病毒感染引起小胶质细胞炎症反应的作用

目前金刚烷胺被（areantadine，Ama）用作一种抗病毒和抗帕金森药物，可抑制小胶质细胞的炎症激活。为验证金刚烷胺是否会抑制乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染小胶质细胞所引起的炎症反应．本试验利用Ama处理小鼠小胶质瘤BV-2细胞系后使用JEV感染细胞，测定细胞中炎性因子的表达，并与单独使用JEV处理BV-2细胞组进行对比分析。结果表明，Ama可以显著降低JEV感染引起的5种炎性因子的表达，MCP-1（62.17％）、IL-6（62．07％）、TNF-α（59．67％）、IL-18（63．16％）以及IL-10（34．24％）。本试验为流行性乙型脑炎的临床治疗提供了理论依据。

一株牛副流感病毒3型毒株的分离鉴定与全基因序列分析

目的采集内蒙古通辽地区某牛场牛鼻拭子样品,PCR检测鼻拭子样品中牛副流感病毒3型(BPIV3)感染情况,研究阳性鼻拭子样品中BPIV3毒株的全长基因组和遗传进化。方法将PCR检测结果呈BPIV3阳性且测序正确的鼻拭子样品接种至MDBK细胞,连续传代5次,然后通过RT-PCR对分离株进行鉴定,并对其进行基因组全长测定及同源性和遗传进化分析。结果成功分离到一株BPIV3毒株,PCR检测结果为阳性,将其命名为NMTL-21。该毒株基因组全长为15454 bp,Karber法结果测得,BPIV3 NMTL-21的半数细胞培养物感染剂量为10^(-7) TCID50/100μL。基于基因组全长序列的同源性和遗传进化分析结果显示,NMTL-21与2015年分离自黑龙江省大庆市的NX49株同源性最高,达99.6%;与2013年分离自北京的XJA13株同源性为99.5%。遗传进化分析结果显示,该毒株为基因C型。结论从病牛鼻拭子样品中成功分离到一株能够致细胞病变的BPIV3-C型毒株,可为进一步开展BPIV3研究提供理论参考和实验材料。

欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗猪免疫试验效果评价

目的评价欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18猪体免疫效果。方法用鉴定正确的重组腺病毒进行猪免疫试验,通过淋巴细胞亚群检测、细胞因子检测和免疫组化检测分析其免疫效果。结果猪淋巴细胞亚群检测显示重组腺病毒pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18刺激CD4+和CD8+表达量在21d、35d、49d分别为PBS组的1.53、1.84、1.90倍和1.41、1.76、1.53倍,差异有统计学意义(P<0.05);ELISA检测pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18免疫猪血清IL-4和IFN-γ水平在14d时的表达量分别是PBS组的1.45和1.46倍(P<0.05),而在35d时分别是PBS组的1.81和1.79倍(P<0.05)。免疫组化检测免疫猪肺、肠系膜淋巴结、腹股沟淋巴组织病毒量相对于野毒组和PBS组显著减少。结论重组腺病毒pacAd-EU-ORF3-ORF5-IL18疫苗,具有良好的免疫原性,能提高猪细胞免疫和体液免疫水平。

牛肠道病毒Syber Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立一种简便快速、特异性和重复性好、灵敏度高的牛肠道病毒(Bovine Enterovirus, BEV)检测方法。方法 根据GenBank公布的BEV基因序列,选取保守区核苷酸序列,利用Pirmer 5.0设计引物,通过PCR扩增目的基因片段,将其连接到pMD18-T载体上构建重组标准品质粒pMD18-T-BEV。构建荧光定量PCR方法,利用软件Quant Studios Design&Analysis Software自动生成标准曲线及溶解曲线。检测其重复性、特异性和灵敏度并与传统PCR方法比较。结果 建立的荧光定量检测方法标准曲线在3.2×10^(1)~3.2×10^(9)拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.997,斜率为-3.387;组间变异系数<3.16%,组内变异系数<1.67%;与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛库布病毒(BKOV)、牛环曲病毒(BTOV)、牛诺如病毒(BNOV)和牛副流感病毒3型(BPIV3)的cDNA样品无交叉反应;最低检测限度为3.2×10^(1)拷贝/μL,是常规PCR检测灵敏度的1 000倍。利用本研究建立的荧光定量检测方法对采集自内蒙古自治区9个盟市的86份牛腹泻样品进行检测,其阳性率为26.74%,远高于传统PCR检测出的阳性率4.56%。结论 本研究成功建立了一种BEV SYBR GreenⅠReal-time PCR方法,该方法具有较高的灵敏度、特异性和可重复性,适用于规模化养殖场牛肠病毒的快速检测。为内蒙古自治区BEV的检测和流行病学调查提供依据。

一株牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的分离鉴定与全基因序列分析

探究内蒙古自治区通辽市牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染毒株主要基因型,为BVDV流行病学及防控提供参考依据。试验前期在内蒙古通辽市某牛场采集腹泻犊牛粪便样品经PCR检测,将BVDV阳性的粪便样品处理后接种到牛肾细胞(MDBK)中进行分离,通过RT-PCR、间接免疫荧光染色对分离株进行鉴定,并对其基因组全长进行测序,根据5′UTR、N pro和E2基因序列进行遗传进化分析和基因分型鉴定。结果表明,试验成功分离到一株BVDV毒株,将其命名为NM-21,接种NM-21的MDBK未产生细胞病变,说明该毒株为非细胞病变型(NCP),RT-PCR、间接免疫荧光染色鉴定均为阳性,病毒滴度为10-3 TCID 50/mL。基于基因组全长序列、5′UTR、N pro和E2基因序列的同源性和遗传进化分析,分离株NM-21与中国内蒙古自治区毒株NM2103(GenBank登录号ON337882.1)核苷酸同源性最高,为BVDV-1c亚型。

一株牛源致病性蜡样芽孢杆菌的分离鉴定与部分生物学特性分析

目的分离鉴定牛源致病性蜡样芽孢杆菌,并分析其部分生物学特性。方法利用PCR方法检测猝死西门塔尔病牛各组织脏器中常见病毒感染情况,同时做涂片镜检,分离感染的细菌,通过形态学观察、生化检测、药敏试验、16SrRNA基因序列分析、毒力基因扩增、动物致病性实验等对分离菌进行鉴定及部分生物学特性分析。结果从猝死牛肝脏中分离到1株革兰阳性蜡样芽孢杆菌,将其命名为TL-19,该菌株含有entFM、nheB、hblD、nblA、nheC、nheA、hblC和cytk等毒力基因,且对小鼠具有较强的致病性,感染鼠24h后全部死亡。结论成功分离到1株牛源蜡样芽孢杆菌TL-19。该菌含有多种毒力基因,通辽市西门塔尔牛猝死与该TL-19感染有关。