丹参SmRopGEF1基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

目的:克隆丹参SmRopGEF1基因,研究其编码蛋白的亚细胞定位及其对逆境胁迫的应激反应和激素诱导下的表达水平。方法:根据前期丹参转录组测序结果设计SmRopGEF1基因特异引物,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增SmRopGEF1基因序列;使用生物信息学方法分析SmRopGEF1蛋白序列特征及进化关系;构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并转化至大肠埃希氏菌中诱导表达,构建35S启动的SmRopGEF1的绿色荧光蛋白原生质体瞬时表达载体,利用激光共聚焦显微镜观察SmRopGEF1的亚细胞定位;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测逆境胁迫(低温、盐及干旱)和激素诱导(生长素、脱落酸、茉莉酸甲酯)下的基因表达量。结果:丹参SmRopGEF1基因开放阅读框(ORF)全长为1701 bp,编码566个氨基酸,蛋白相对分子质量是62362.99。生物信息学分析显示SmRopGEF1蛋白含有1个PRONE保守结构域,系统进化树分析表明SmRopGEF1蛋白与芡欧鼠尾草和一串红RopGEF1蛋白为高同源蛋白。成功构建pET28a-SmRopGEF1原核表达载体并在大肠埃希氏菌Rosetta(DE3)菌株中表达、纯化出SmRopGEF1重组蛋白。亚细胞定位的结果显示SmRopGEF1存在于植物细胞的细胞核中。qRT-PCR实验结果表明盐胁迫和冷胁迫能够显著提高SmRopGEF1的表达量;干旱胁迫后丹参愈伤中SmRopGEF1表达量下降。茉莉酸甲酯诱导后SmRopGEF1表达量升高。结论:克隆了丹参SmRopGEF1基因,其在抗逆胁迫中起到重要作用并且可能参与茉莉酸甲酯信号转导。研究结果丰富了丹参防御反应机制的研究,为选育丹参抗逆优良品种、提高丹参的产量与品质提供了参考。

三七配方颗粒新型制备工艺研究及表征

目的:通过对比分析配方颗粒的吸湿性以及IR、DSC、XRD和SEM等表征结果,考察新型制备工艺的合理性与可行性。方法:通过考察不同混合方式下的三七配方颗粒的吸湿性,同时运用IR、XRD、DSC和SEM等分析手段对配方颗粒进行表征。结果:通过对比5种常用辅料,新型混合工艺制备的配方颗粒的平衡吸湿量较传统工艺降低范围在18%~30%,平衡时间延长范围在13%~17%;经新型混合工艺制备的配方颗粒其药物有效成分与辅料未发生物理与化学变化,提取物在颗粒中更多以无定形或微晶形式存在,同时颗粒表面结构有较大改观。结论:新型工艺制备的配方颗粒吸湿性较好,提取物与辅料未发生物理化学变化,表面结构平整光滑,说明新型制备工艺适用于中药配方颗粒的生产。

三七提取物的制备工艺对其抗凝血生物效价的影响

目的:考察三七提取物的制备工艺对其抗凝血生物效价的影响。方法:采用不同提取/干燥方法,制备三七提取物,并测定其抗凝血活性,根据量反应平行法计算生物效价;采用HPLC法测定提取物活性成分;并对活性成分与生物效价进行线性关联分析。结果:当物料比为1∶8时,80%乙醇超声提取结合冷冻干燥法所得到的提取物生物效价最高;且生物效价与活性成分之间呈显著正相关,R^2为0.7837。结论:三七提取物的制备工艺可显著影响其抗凝血生物活性。

基于KingSCADA粮库数据采集与监控系统研究与实现

介绍了基于KingSCADA的粮库数据采集和处理系统,实时监控分布在不同地点的数据信息。该监控系统为分布在异地的采集点提供统一的数据采集方式,为各业务应用模块提供统一的数据接口服务,并实现了C/S、B/S两种模式的访问。该系统能够实现粮仓管理、温湿度巡检、超限报警、历史查询、打印报表等功能。

桔梗特异DNA条形码筛选、种质资源鉴定及遗传多样性分析

中药材桔梗为桔梗科植物桔梗的干燥根,具有多种药理作用,是常用的大宗中药材。本研究利用Illumina HiSeq X Ten平台对6份来自不同产地的桔梗进行叶绿体基因组测序,筛选特异性DNA条形码,基于特异性DNA条形码对不同产区的桔梗样品的种质资源和遗传多样性进行分析。6份桔梗叶绿体基因组全长为172260~172275 bp,均呈现典型的环状四分体结构,编码141个基因。根据比较基因组学分析和扩增效率分析发现trnG-UCC和ndhG_ndhF可作为潜在的桔梗种内种质资源鉴定的特异性DNA条形码。对来自9省15个产地305份桔梗样品的trnG-UCC和ndhG_ndhF进行PCR扩增和序列分析,结果表明trnG-UCC和ndhG_ndhF分别有5和11个变异位点,分别鉴定到5和7个单倍型;两段序列联合分析鉴定13个单倍型(Hap1~Hap13),其中占比最多的是Hap4,其次是Hap1。3个产地拥有的特异单倍型,可作为该产地的DNA分子标签与其他产地的桔梗种质资源进行区分。单倍型多样性、核苷酸多样性和遗传距离分别为0.94、4.79×10^(-3)和0.0000~0.0203,表明桔梗在物种水平上有较高的遗传多样性,种内各单倍型之间亲缘关系比较接近。本研究为桔梗产地鉴定、种质资源保护利用和分子育种等工作奠定基础。

北柴胡特异DNA 条形码筛选及种质资源鉴定

目的基于北柴胡Bupleurum chinense叶绿体基因组筛选特异性DNA条形码,并利用特异DNA条形码鉴定不同产地北柴胡种质资源。方法利用Illumina HiSeq X Ten平台对北柴胡进行叶绿体基因组测序,利用mVISTA软件和核酸多样性分析筛选特异性片段,基于特异性片段进一步分析不同产区北柴胡样品单倍型。结果不同产地3份北柴胡叶绿体基因组全长为155557~155959 bp,均呈现典型的环状四分体结构,均编码131个基因。trnV-UAC、trnC-GCA_petN、petN_psbM、ndhF_rpl32可以作为潜在的北柴胡种质资源鉴定的特异性DNA条形码。基于扩增效率,选择petN_psbM和ndhF_rpl32对来自4省7个产地177份北柴胡样品进行序列分析,结果表明petN_psbM和ndhF_rpl32分别有91和78个变异位点,分别鉴定到28、29个单倍型;两段序列联合分析形成40个单倍型(Hap1~Hap40),各单倍型的遗传距离为0~0.022。6个产地拥有特有单倍型,可以将不同产地的北柴胡种质资源进行区分。结论利用比较叶绿体基因组学筛选的特异DNA条形码petN_psbM和ndhF_rpl32可以用于北柴胡种内种质资源鉴定,为后续鉴定北柴胡的产地来源、种质资源保护利用和育种等工作奠定基础。

北苍术特异性DNA条形码筛选、种质资源鉴定及遗传多样性分析

北苍术Atractylodes chinensis具有重要药用价值和经济价值。本研究利用Illumina平台测序获得4份不同产地的北苍术的叶绿体全基因组序列,筛选特异DNA条形码,并利用特异DNA条形码对不同产区北苍术样品种质资源鉴定及居群的遗传多样性分析。该4份北苍术叶绿体全基因组均为典型的环状四分体结构,均注释112个基因。比较基因组学研究结果表明ccsA和trnC-GCA_petN是潜在的北苍术种内鉴别的特异DNA条形码。选择ccsA和trnC-GCA_petN对来自9省14产区的256份样品进行PCR扩增,扩增效率为100%。序列分析结果表明ccsA和trnC-GCA_petN分别有11和22个变异位点,分别能鉴定16和22个单倍型,两段序列联合分析鉴定39个单倍型,命名为Hap1~Hap39,其中占比最多和分布最广的基因型为Hap9。单倍型多样性(Hd)=0.896,核苷酸多样性(Pi)=0.002 22,说明北苍术在物种水平上有较高的遗传多样性。各单倍型的遗传距离为0.000 00~0.004 88,说明各个单倍型之间有较小的遗传差异。系统进化树分析结果表明, 39个单倍型有很近的亲缘关系,并且与除白术外其余同属类群形成明显的两个分支。本研究为后续鉴定北苍术产地来源和后续种质资源保护和育种方面起到重要作用。

刺五加特异性DNA条形码筛选、种质资源鉴定及遗传多样性分析

刺五加Eleutherococcus senticosus是东北地区道地药材之一。该研究对来源于不同道地产区的3份刺五加的叶绿体基因组进行比较分析并筛选特异性DNA条形码,并基于筛选出的特异性DNA条形码对道地产区的刺五加进行种质资源鉴定和遗传多样性分析。3个不同道地产区的刺五加叶绿体基因组全长为156779~156781 bp,叶绿体基因组呈典型的四分体结构,含有的基因数量均为132个,其中蛋白质编码基因87个,tRNA 37个,rRNA 8个,其叶绿体基因组比较保守。叶绿体基因组序列分析结果表明atpI、ndhA、ycf1、atpB-rbcL、ndhF-rpl32、petA-psbJ、psbM-psbD、rps16-psbK可作为潜在的刺五加特异性DNA条形码。该研究选择序列长度为700~800 bp且易于扩增的atpI和atpB-rbcL片段对道地产区的13个产地184份刺五加样品进行扩增,序列分析结果表明atpI和atpB-rbcL分别能鉴定9、8个基因型,2段序列联合分析形成23个基因型,命名为H1~H23,分布最广和占比最多的单倍型为H10,H2次之;单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.94和1.82×10^(-3),遗传多样性较为丰富;中介邻接网络分析结果显示23种基因型可分为4类,其中,单倍型H2是最古老单倍型,并以H2为中心呈星状辐射,说明其在道地产区发生种群扩张。该研究可为刺五加道地药材遗传品质研究和刺五加的叶绿体基因工程研究奠定基础,进一步加深对刺五加居群的遗传机制研究,为刺五加遗传进化研究提供新思路。

基于叶绿体基因matK及UPLC对市售大黄的种质资源鉴定和质量分析

大黄是多基原大宗常用药材,不同基原大黄其药理活性存在一定差异。本研究基于叶绿体基因matK序列对市售大黄饮片的种质资源进行鉴定,通过UPLC对其总蒽醌和游离蒽醌含量进行测定,以期确定市售大黄的主要种质及质量。本研究从27省40市收集89份市售大黄样品并提取DNA,通过PCR扩增matK基因,扩增的matK基因序列的分析结果表明,收集的市售大黄样品都是同一基原,即掌叶大黄,共鉴定了其8个基因型:Rp1、Rp2、Rp3、Rp4、Rp5、Rp6、Rp10和Rp12,其中来自甘肃、四川和云南省的Rp4和Rp6是主要流通基因型,分别占总样品量40.45%和37.08%。系统发育树结果表明,8个基因型主要分成2大支,其中主要基因型Rp4和Rp6聚在同一大支,遗传距离分析结果表明8个基因型遗传距离在0.001~0.010之间。利用UPLC检测市场样品中的总蒽醌和游离蒽醌含量结果表明,93.26%样品符合药典标准。样品之间总蒽醌含量和游离蒽醌的含量差异显著,其中游离蒽醌相差1.01%;总蒽醌含量相差3.79%,说明市售大黄样品质量存在参差不齐的现象,但是不同采集省份之间市售大黄总蒽醌和游离蒽醌含量没有显著性差异,各基因型之间的大黄样品中总蒽醌和游离蒽醌含量没有显著性差异。本文对大黄市场样品的种质资源、产地来源和药材质量进行研究,有利于指导大黄市场样品流通及临床科学合理用药,为其他中药材市场样品种质及质量鉴定提供参考。

三七PnMYB1R1基因的克隆、亚细胞定位与不同胁迫下的表达分析

MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一,在植物信号转导、生长发育和植物防御反应中起到重要作用。本研究以三七(Panax notoginseng)为材料,设计特异引物,克隆了三七中1R-MYB转录因子PnMYB1R1基因,并进行氨基酸序列分析、原核表达和纯化、亚细胞定位、转录活性分析、组织特异性分析及非生物胁迫下的诱导表达分析。PnMYB1R1基因开放阅读框(ORF)长738 bp,编码245个氨基酸,蛋白分子质量27.0 kD。序列分析及系统进化树结果表明PnMYB1R1包含1个保守的R3结构域,属于1R-MYB型转录因子中的TRF-like类蛋白。构建原核表达载体pET28a-PnMYB1R1并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达PnMYB1R1重组蛋白,纯化得到可溶性重组蛋白。亚细胞定位实验结果表明PnMYB1R1定位于植物细胞的细胞核中。转录活性分析显示PnMYB1R1转录因子具有转录激活活性。实时荧光定量PCR结果表明PnMYB1R1基因在三七主根中表达量最高,茎、叶次之,须根中表达量最低。盐、低温及干旱胁迫均能够影响主根、须根、茎、叶中PnMYB1R1基因的表达水平,其中盐胁迫能够显著提高主根、须根、茎和叶中PnMYB1R1基因的表达水平。本研究为进一步揭示1R-MYB转录因子在三七中防御反应中作用奠定基础。

基于DNA条形码及HPLC对市售黄芩的种质资源鉴定和质量评价

黄芩Scutellaria baicalensis是我国常用的大宗药材,该研究根据以前的叶绿体基因组测序结果,选取trnH-psbA、petA-psbJ、ycf4-cemA序列对市售黄芩样品进行种质资源鉴定,并通过HPLC测定市售样品的黄芩苷含量,以期确定检测黄芩市场样品的最佳DNA条形码,市场样品的种质资源和质量。该研究从我国24个省收集104份样品并提取DNA进行PCR扩增,trnH-psbA、petA-psbJ、ycf4-cemA 3段序列的扩增效率分别为100%、59.62%、25.96%;序列分析结果表明利用trnH-psbA、petA-psbJ、ycf4-cemA分别能够鉴定5、4、2个基因型,但是与野生型基因型序列不相同,3段序列联合分析仅形成6个基因型;系统进化树和遗传距离分析结果表明,trnH-psbA片段可用于鉴别黄芩真伪样品,因此trnH-psbA片段为鉴定市场样品种质资源最佳片段,对其所鉴定的市场样品基因型(THap1~THap5)进行分析,发现THap2为市场样品主要流通基因型,占总样品量的86.55%,说明市场黄芩样品种质资源比较少。HPLC检测市售黄芩样品中的黄芩苷含量结果表明,所有采集的市售黄芩样品黄芩苷含量均超过药典规定标准,样品之间黄芩苷含量差异显著,最大相差12.21%,说明市售黄芩样品质量参差不齐,而且不同采集省份和各个基因型之间的黄芩苷含量没有显著性差异。该研究为建立黄芩鉴定标准化体系提供依据,有利于指导黄芩市场样品的流通及临床科学合理用药。