一株猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的分离鉴定及攻毒模型建立

从一只临床表现为流脓涕、打喷嚏的猫身上分离出一株猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus typeⅠ,FHV-1),使用F81细胞进行分离,并通过PCR、透射电镜和糖蛋白D(gD)基因序列分析来鉴定病毒。通过PCR方法从猫的鼻分泌物中扩增出1125 bp的gD基因。序列分析表明,该分离株与从GenBank获得的其他FHV-1毒株属于同一家族。随后在接种猫鼻分泌物的F81细胞的培养上清中观察到有包膜和直径约120 nm左右的疱疹样病毒颗粒。将分离获得的FHV-1病毒感染2~3月龄蓝猫,成功建立动物实验模型,感染后的猫出现脓性的眼鼻分泌物,打喷嚏等临床症状,且一周内持续排毒。该分离株为FHV-1的病原学研究提供了重要的数据,也为猫鼻气管炎疫苗候选株的筛选和疫苗的研发奠定了基础。

全悬浮培养LMH细胞制备FAdV-4灭活疫苗的研究

通过对LMH细胞进行驯化,获得一株可全悬浮培养的LMH细胞,命名为LMH-S。此细胞可适应无血清、高密度悬浮培养,以初始细胞密度0.5×10^(6)/mL~1×10^(6)/mL接种,细胞密度最高达6×10^(6)/mL。研究确定生物反应器悬浮培养LMH-S细胞制备FAdV-4抗原的最优参数为:接毒时细胞密度2×10^(6)/mL~3×10^(6)/mL、接毒量0.1MOI~1MOI、接毒后48h~72h收毒,所获抗原病毒含量不低于10^(9.25)TCID_(50)/mL。试验鸡分别免疫0.02mL、0.05mL、0.1mL、0.3mL疫苗,攻毒保护率分别为9/10、10/10、10/10、10/10,表明疫苗有效性良好。本试验成功建立了LMH全悬浮培养细胞株,确定了FAdV-4抗原的生物反应器悬浮培养工艺,验证了悬浮培养抗原的免疫原性,为高效FAdV-4灭活疫苗的研制奠定了基础。

微载体悬浮培养ST细胞增殖猪瘟兔化弱毒的工艺研究

从细胞接种密度、病毒接毒量、培养基三个方面进行研究和优化,并进行放大培养,建立了猪瘟病毒的微载体悬浮培养工艺:细胞接种密度为每个微载体15个细胞,病毒接毒量0.05 MOI,采用DMEM/F12培养基进行培养和细胞消化瓶批式消化分散细胞,培养的细胞可以完成生物反应器10 L到50 L的放大,培养的病毒含量达到7.6 lgTCID 50/mL、不低于400万RID/mL,工艺稳定可靠,为猪瘟疫苗工业化大规模微载体悬浮培养奠定了基础。

ST细胞全悬浮培养的驯化及其培养伪狂犬病毒的工艺研究

将Siat7e基因转染ST细胞,筛选,驯化得到一株可悬浮培养的ST细胞株,此株细胞能够稳定连续传代,适应无血清、高密度培养,最高密度可达6×10^(6)/mL,从摇瓶放大至生物反应器,生长稳定;采用驯化的全悬浮ST细胞培养伪狂犬病毒,从接毒时细胞密度、接毒量、收获时间三个方面优化了伪狂犬病毒的培养参数,确定接毒时细胞密度为2.0×10^(6)/mL~3.0×10^(6)/mL,接毒量为0.1 MOI~1 MOI,收毒时间为接毒后24 h~36 h。经过50 L生物反应器3个批次的工艺验证,培养的病毒含量均不低于109.0TCID50/mL,说明驯化的ST全悬浮细胞适合伪狂犬病毒的培养。

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属于黄病毒科瘟病毒属,在基因组序列上有很高的同源性,2种病毒交叉污染的情况十分严重,给疫病诊断和疫苗质量控制带来很大麻烦。为了更好的对这2种病的病原进行分子生物学鉴别检测,参考GenBank上2种病毒标准株的基因组序列,选取各自的保守基因区域设计可以进行鉴别检测的特异性引物,经过对PCR反应条件的优化,建立了可以对2种病毒同时检测的双重RT-PCR方法。该方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪日本脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪圆环病毒2型的扩增结果均为阴性;该检测方法的敏感性为5ng病毒基因组RNA。建立的猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高,可以用于2种疫病的临床分子检测,也可用于猪瘟疫苗的质量控制,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。

血清3型鸭甲型肝炎病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用

通过对GenBank公布的鸭甲型肝炎病毒全序列比对,在3型鸭甲肝炎病毒(DHVA-3)5’非编码区的保守区,设计了一对检测引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的阳性重组质粒经体外转录合成的RNA作为标准品绘制标准曲线,建立了一种快速检测DHAV-3的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法能特异性地检测出DHAV-3,而与血清1型鸭肝炎病毒(DHAV-1)、鸭瘟病毒、新城疫病毒、禽流感病毒(H9)、呼肠孤病毒、传染性支气管炎病毒无交叉反应。在1.8×103～1.8×108copies/μL的检测范围内标准曲线线性关系较好,R2为0.992。敏感性试验表明,最低检测限为36拷贝数RNA。用该方法和胚半数致死量法对尿囊液中病毒含量进行检测,表明二种方法检测结果呈正相关。本研究所建立的检测方法特异性好,灵敏度高,且操作方便,可为该病毒的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

猪伪狂犬病毒C株的分离鉴定

在流行病学调查中分离到的1株伪狂犬病毒,命名为猪伪狂犬病毒C株,并对其进行鉴定、纯化。在gE和gI基因段上设计特异性引物进行PCR检测,闽A株在5 000 bp处出现目的条带,该毒株在1 500 bp附近出现目的条带,对目的条带测序,扩增产物大小为1 538 bp,在第989—4 468位基因缺失,缺失片段大小为3 570 bp,该缺失片段包含了伪狂犬病病毒的主要毒力基因(gE基因),除此缺失片段外,分别在第873、4 665、4 666、4 950位发生了碱基突变,同猪伪狂犬病病毒Bartha K61同源性为95.0%—96.0%,与PRV Bartha K61不是同一个毒株。用该毒株对部分省市分离到的伪狂犬毒株和标准毒株闽A株进行中和试验,中和指数为708—6 761,该毒株可完全中和临床分离的伪狂犬病毒株,故可用作候选疫苗毒株。

鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用

通过使用血清3型鸭甲型肝炎疫苗毒免疫SPF鸡,制备血清3型鸭甲型肝炎诊断用标准阳性血清,对制备血清进行无菌、支原体和特异性检验以及效价测定,并用该抗血清进行鸭病毒性肝炎治疗试验。结果表明,该血清无菌检验合格,无支原体污染,特异性良好,无禽类常见13种外源病毒抗体,血清中和效价为10-2.8。发病雏鸭紧急治疗保护率为91.67%,而与血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1)无交叉保护。

DNA荧光染色和PCR技术在PRRSV冻干疫苗中支原体检测的应用

为完善猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)冻干疫苗生产各阶段的支原体检测体系,本研究分别应用DNA荧光染色法、PCR法和病毒分离培养法检测疫苗生产中的细胞、种毒、半成品、成品,分析方法的可行性和优势。结果显示,DNA荧光染色法检测PRRSV半成品抗原液的支原体污染能够于6 d内得到结果,与其余半成品检验项目用时相近,适宜在生产中应用。而采用DNA荧光染色、PCR和病毒分离培养法对我们生产的10批PRRSV冻干疫苗成品的支原体检测结果显示,DNA荧光染色法与病毒分离培养法检测的结果一致,1批疫苗的PCR检测结果与培养法检测结果不符,即PCR法检测阳性,但DNA荧光染色和病毒分离培养法检测为阴性。由此证明,DNA荧光染色法和PCR法检测疫苗中支原体的结果可靠,而PCR法检出率更高。DNA荧光染色法和PCR法操作简便、快速、经济,可以作为疫苗生产质量的内控标准,提高支原体的检出率,保证疫苗质量。

抗狂犬病毒单克隆抗体的研制及应用

应用杂交瘤技术获得4株分泌抗狂犬病毒（Rabies virus,RV）单克隆抗体细胞株,并对其特性进行分析。经鉴定,它们所分泌的抗体类型为IgG1,腹水效价为1∶105~1∶107,ELISA法和间接免疫荧光检测（indirect immunofluoreseent assay,IFA）结果表明：该4株单抗对RV有良好的特异性,对正常Vero细胞及人白蛋白和其他细胞培养物无非特异性反应。将这些单抗腹水进行Protein G亲和层析纯化后获得的纯化抗体用于制备反相亲和层析柱,并以反相亲和层析法纯化RV以获得高纯度RV抗原。应用纯化的RV建立胶体金免疫层析法（gold-immunochromatography assay,GICA）检测RV抗体血清,结果显示,GICA与标准ELISA法检测比较的总符合率为96.1%。

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗耐热冻干保护剂的试验

目前，弱毒活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，在我国动物用疫苗中，活疫苗占相当大的比例。国内疫苗企业常用的保护剂主要是蔗糖、牛奶、明胶等，组方简单，保护性能差。如果在2℃～8℃条件下，保存期只有3～6个月，多需要在-15℃以下保存。而国内传统的动物用疫苗保护剂的研制相对滞后，使疫苗的长期保存和长途运输受到很大限制，加上基层防疫部门缺乏必要的冷冻和冷藏设施，容易因免疫失效而造成疫病流行。

IFA和IPMA方法测定猪瘟兔化弱毒病毒含量

使用间接免疫荧光方法(IFA)和过氧化物酶单层试验(IPMA)测定猪瘟兔化弱毒的病毒含量(TCID50)。两种方法都使用韩国JBT公司猪瘟单抗作为一抗,此单抗的稀释倍数最高为300倍。Trueblue过氧化物酶底物显色的、感染猪瘟兔化弱毒的阳性细胞呈现蓝色,易于辨识,所以确定Trueblue为IPMA方法中的酶作用底物。建立的的IFA和IPMA方法与兔体反应热法进行了比较,证明两者存在一定平行关系,但IFA和IPMA比兔体反应热法检测结果的数值低1个数量级左右。基于以上结果,TCID50方法可作为猪瘟疫苗效力检验的候选方法。

BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响

为分析BHK-21细胞不同处理方式对裸鼠致瘤性的影响,分别用甲醛、二乙烯亚胺(BEI)、β-丙内酯(BPL)进行灭活和在-20℃进行冻融处理的BHK-21细胞接种裸鼠,通过病理组织形态学观察判定其是否存在致肿瘤的特性。结果显示,甲醛、BEI、BPL、冻融2次或3次分别处理的BHK-21细胞接种裸鼠,对裸鼠致瘤率为零。冻融1次的BHK-21细胞和10~7、10~5和10~3个BHK-21细胞分别接种裸鼠,致瘤率为100%。10个BHK-21细胞接种裸鼠,未见成瘤。试验表明,裸鼠检测BHK-21细胞致瘤性敏感性为10~3个细胞;冻融2次、甲醛、BEI、BPL处理,BHK-21细胞均丧失致瘤性;冻融1次不能使BHK-21细胞丧失致瘤性。

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种牛病毒性腹泻-粘膜病病毒(BVDV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV基因序列,针对5’UTR的保守序列,设计合成了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针。通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了一种能快速定量检测BVDV的荧光定量RT-PCR检测方法。通过对20份胎牛血清样品和猪瘟细胞苗半成品进行检测,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的方法能检测到BVDV,而对CSFV、PRRSV和MDBK细胞的扩增结果均为阴性,具有高度的特异性。在所检测的20份样品中,BVDV阳性6份(30%)。对所构建的标准品进行检测,在102～108拷贝/μL的范围内可以得到良好的动力学曲线,能检测低至103～104拷贝/mL的病毒量。表明所建立的检测方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等特点,可用于临床及科研中对BVDV的快速定量检测和对牛血清及猪瘟兔化弱毒疫苗等生物制品中是否污染BVDV进行监测。

犬细小病毒胶体金检测试纸条的制备与初步评价

为快速检测及诊断犬细小病毒及其引起的传染性疾病,应用胶体金免疫层析技术,采用柠檬酸三钠还原法制备25 nm的胶体金颗粒,标记抗犬细小病毒单克隆抗体CPV-F1株后包被于玻璃纤维膜作为金标垫,在硝酸纤维素膜上分别包被羊抗小鼠IgG二抗和抗犬细小病毒单克隆抗体CPV-B6株作为质控线和检测线,将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫分别粘贴于背衬板上制成犬细小病毒抗原胶体金检测试纸条。特异性试验及与血凝试验的对比结果表明,该试纸条具有良好的特异性和敏感性,与进口产品的总符合率为98%。本研究为进一步研发犬细小病毒检测试纸奠定了基础。

分泌抗犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

为制备犬细小病毒(CPV)单克隆抗体,用F81细胞繁殖CPV,病毒液经二乙烯亚胺(BEI)灭活、纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经筛选获得2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为F1和B6。F1和B6分泌的单克隆抗体Ig亚类均为IgG1;以F1和B6制备的腹水,经检测,间接ELISA效价均为1×105,免疫荧光效价分别为1∶3200和1∶6400;F1和B6培养上清的抗体中和效价分别为1∶1024和1∶2048,血凝抑制效价分别为1∶2048和1∶4096;免疫印迹(Western-blotting)和抗原表位分析结果显示,F1和B6分泌的单克隆抗体可能分别针对CPV的空间表位和线性表位。2株分泌抗CPV单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立可进一步用于开发CPV特异性诊断制剂和治疗制剂。

猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)对兔与猪免疫攻毒保护平行关系研究

用研制的连续3批猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)分别以不同剂量免疫健康兔和断奶仔猪,检测其免疫28 d后的血清抗体,采用血清中和试验法测定血清中和指数,并对免疫28 d后的兔和断奶仔猪分别进行攻毒,统计各组兔和断奶仔猪免疫后攻毒保护率。结果表明,兔免疫28 d后的血清抗体中和指数为794～1258时保护率为60%～80%,血清抗体中和指数≥1479时可获得100%保护;仔猪免疫28 d后的血清抗体中和指数为229～269时保护率为60%～80%,血清抗体中和指数≥331时可获得100%保护。兔与仔猪对猪伪狂犬病灭活疫苗(HB-J株)均产生良好的免疫应答反应,抗体值较高者获得保护率相对较高,兔与猪免疫与攻毒保护呈现平行关系。

犬狂犬病毒抗体胶体金检测试纸卡的研制

为快速检测犬狂犬病毒IgG抗体,应用狂犬病毒G蛋白作为捕获抗原,鼠抗狂犬病毒G蛋白单克隆抗体和羊抗犬IgG分别作为胶体金标记物和诊断抗体,羊抗鼠IgG作为质控线,制备胶体金免疫层析抗体检测试纸。该试纸卡具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,与快速荧光灶抑制实验检测值对比总符合率为82.1%。研究显示,本试纸卡能够快速、准确检测犬狂犬病毒IgG抗体,可为临床诊断和宠物犬狂犬疫苗免疫效果的评价提供参考。

猪圆环病毒2型Cap蛋白ELISA检测方法的建立及初步应用

将杆状病毒表达系统表达并经梯度离心纯化的PCV2 Cap蛋白作为标准品,利用双抗夹心法建立了针对猪圆环病毒2型Cap蛋白的ELISA检测方法,并应用于圆环病毒2型基因工程疫苗的质控。结果表明,多抗最适包被浓度为1μg/mL,最佳封闭液为1%BSA,最佳单抗反应浓度为2μg/mL,反应时间60 min,最佳二抗使用稀释度1∶40000,反应时间60 min。该方法与Sf9细胞、BSA和其他猪病病毒抗原之间无交叉反应,最低检测抗原量为5 ng。

制作多聚赖氨酸黏附载玻片四种方法比较分析

本研究以常规浸泡法、棉签涂布法、一次推片法和两次推片法分别制作多聚赖氨酸黏附载玻片,比较分析四种方法的黏附效果、防尘效果、实用性和经济性.结果表明,多聚赖氨酸与蒸馏水以3 ： 2比例稀释时,常规浸泡法、一次推片法和两次推片法黏附率均在98%以上,常规浸泡法可用于大批量制作,推片法防尘效果较好且便于操作,两次推片法黏附效果最好,一次推片法最经济.