表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染

通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)的cDNA成功地引入番茄(Lycopersicon esculentum)植株中,并得到转基因植株。用强致病力CMV株系接种后,表达CMV外壳蛋白的转基因植株表现出对CMV侵染的抗性。转基因植株RI代的抗性基因以接近3:1比例分离。对R_1代接种CMV后,表达CMV CP的植株病症减轻,发病率、病情指数及病毒积累量明显低于对照。病症出现推迟1个多月。

水稻中一种抗真菌蛋白的分离与特性分析

从萌发的水稻种子中分离并纯化了一种能抑制多种病原真菌生长的蛋白（简称为ＲＡＦＰＩ），在马铃薯葡糖琼脂培养基上，２０μｇＲＡＦＰＩ可明显抑制木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）菌丝的生长，此蛋白还具有较广的抗真菌菌谱，其分子量为１６．５９ＫＤ，等电点为８．７，组成成分中富含Ｐｒｏ、ＧｌＸ和Ａｓｘ，经测序得到了其Ｎ端２０个氨基酸序列。

水稻钙调蛋白基因的克隆及结构分析

钙调蛋白是生物细胞内一种重要的调控蛋白，通过其与靶酶的相互作用，控制细胞正常的生长和发育。我们以湖北光敏感核不育水稻ｃＤＮＡ第一条链为模板，参考大麦钙调蛋白基因序列合成５＇端和３＇端引物，利用多聚酶链式反应合成了完整的水稻钙调蛋白ｃＤＮＡ，克隆并测定其序列。结果表明，光敏核不育水稻的钙调蛋白基因由４５０个核苷酸组成，共码１４８个氨基酸。

高效马铃薯遗传转化体系的建立及甜蛋白基因的导入

本研究选用了三个马铃薯(Solanum Iuberosum L.)栽培品种“85T-14-3”、“86-2”及“Favorita”的块茎、微型薯和试管薯为起始材料,应用根癌农杆菌 Ti 质粒系统成功地建立了一种方法简单、速度快和频率高的遗传转化体系。其中试管薯薄片的转化速度最快,经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)共培养后,薄片在100mg/L 卡那霉素的分化培养上,2—3周就可产生出抗性小芽,这些小芽进一步仲长后可在50—100mg/L 卡那霉素的无激素MS 培养基上生根。从共培养到转化植株的获得只需6—7周。微型薯和试管薯的转化频率较高,最高可达67.5%。大多数抗性植株均能检测到胭脂碱合成酶或 GUS 基因的表达。把带有甜蛋白基因和胭脂碱合成酶标记基因的Ti质粒导入马铃薯,获得大量转化植株。叶片抗性检测和 nopaline 检测可推断外源甜蛋白基因已进入马铃薯基因组。

小麦对赤霉病抗性不同品种的SOD活性

本研究对9个赤霉病抗性不同小麦品种采用赤霉病菌分生孢子悬浮液以单花针注法进行了田间和温室抗病性鉴定;测定了各品种的胚性愈伤组织和盛花期麦穗分别经赤霉病菌毒素和分生孢子接种前后SOD活性的变化。结果表明,各品种SOD活性与其对赤霉病抗性呈极显著的正相关。接种后寄主的SOD活性均有提高,抗病品种比感病品种提高幅度大,且有新的同工酶带出现。抗病品种望水白比感病品种Alondra“S”多出两条SOD同工酶谱带。SOD在小麦抗赤霉病上可能起积极作用,其活性有可能作为鉴定小麦抗赤霉病的一种生理生化指标。

枯草芽孢杆菌A014菌株防治小麦赤霉病的初步研究

室内平皿抑菌作用测定、盆栽和田间小区试验初步结果表明:枯草芽孢杆菌菌株A014对小麦赤霉菌有较强的抑菌作用,并有一定的防病效果,使病菌侵染率降低50.6％,能较好地保护麦穗不受病菌侵染或限制穗部病菌的扩展。

枯草芽孢杆菌TG26防病增产效应的研究

枯草芽孢杆菌TG26分离自丝瓜根部土壤,对多种植物病原菌有强烈抑菌活性。在小麦感病品种盆栽试验中,对小麦赤霉病的防效为82.25～89.80％;浸根处理对西瓜枯萎病和烟草青枯病的苗期防效可达100％。田间小区试验结果,该菌剂对小麦赤霉病、西瓜枯萎病和烟草青枯病的防效分别为76.4％、73.1％和79.6％,并有明显的增产效应。其分泌的抗菌蛋白对植物病原菌有很强的抑菌作用。

水稻矮缩病毒基因组第五号片段编码区的cDNA克隆及序列分析

水稻矮病毒(RDV)基因组第五号片段S5编码病毒的外层外壳蛋白(outer layer coatprotein)。从RDV中国福建分离物中分离出S5的双链RNA,反转录成cDNA,再利用PCR扩增了编码区cDNA,将扩增产物克隆到载体pBluescript上。经限制性内切酶分析,进而进行亚克隆和序列测定。结果表明,克隆片段全长2449bp,包含一个编码801个氨基酸的完整开放阅读框架。与RDV日本分离物S5相比,核苷酸和由此推出的氨基酸的同源率分别为94.5％和97.5％。与同组伤瘤病毒(WTV)相比,核苷酸和氨基酸的同源性分别高达58.1％和51.1％,S5是RDV与WTV基因组中同源性最高的片段。

水稻矮缩病毒(RDV)基因组cDNA克隆和部分DNA序列分析

采用氯仿处理、聚乙二醇沉淀和蔗糖密度梯度离心的方法,从感病的水稻叶片中分离、纯化了水稻矮缩病毒(RDV)。在琼脂糖凝胶板上电泳分离到了9个 RNA 片段的 RDV 基因组。用电泳回收的方法纯化了 RDV 基因组的各 RNA 片段。利用 ollgo dT 作为引物,合成并克隆了其中几个片段的 cDNA。通过对 cDNA 克隆的物理图谱分析,建立了亚克隆,测定了它们的 cDNA 序列。这里报告其中第8条片段的 cDNA 部分序列。

番茄丛矮病毒组(Tombusviruses)成员外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白

应用South-western技术以番茄丛矮病毒组(tombusvirus)6种病毒为材料研究了它们的外壳蛋白对单双链DNA的结合作用。结果表明tombus-组6种病毒(PLCV,AMCV,CNV,CyRSV,PAMV,TBSV)的外壳蛋白及PLCV重组外壳蛋白是一种单双链DNA结合蛋白,对单链DNA的结合能力远远超过双链DNA。这种结合作用可能与在tombus一组病毒外壳蛋白立体空间结构有关,因为当蛋白变性时结合作用大大降低。另外,一旦外壳蛋白与单链DNA发生相互作用,用4moL/L尿素或0.1％SDS在90°C水浴中难以洗掉。Tombus一组病毒外壳蛋白这种对单双链DNA的结合作用可能表明它们是一种参与病毒体内运输或调节复制的蛋白。

对转基因香料烟PK-873几个重要质量性状的研究

通过对转基因香料烟PK-873自1989年进入大田试验以来,各种重要农业性状的系统化研究,发现该品种抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,简称TMV)性能突出,遗传稳定性好,且栽培管理和晾制过程简单易行,宜在我国东北、华北和黄淮平原种植。在辽宁丹东自然条件下该品种田间发病率一般低于千分之一。人工接种TMV(0.5μg/mL)40d后,发病率一般不足20％。烟草总公司组织的评吸试验证明PK-873的质地优于国内主要香料烟品种(沙姆逊和泰国一号)。

CAT和GUS基因在水稻玉米等作物原生质体中的瞬间表达

使用电击法和 PEG 法将 CAT 和 GUS 基因分别与 CaMV 35S 启动子构成的两种嵌合基因,转移到水稻、玉米、烟草、胡萝卜和香石竹(Dianthus caryophyllus)等品种的原生质体中,均得到了瞬间表达。在电击法中,大多数转化后玉米、烟草和胡萝卜原生质体表现出明显的基因活性。转化效率与所用仪器的电击参数有关。PEG 转化中 PEG 处理时间较国外报道稍有缩短,但转化后的水稻、烟草、胡萝卜和香石竹样品中均得到了阳性结果。

大豆提取液对超结瘤现象的抑制

将超结瘤大豆(Glycine max)突变体nts 382用一定数量的固氮菌接种后,这些植株上产生大大多于同样条件下生长的野生型亲本Bragg植株上所形成的根瘤。把nts 382幼苗地上部的抽提液加入培养基中,不能使Bragg的幼苗表现为超结瘤型,但若把Bragg幼苗抽提液加入nts 382培养基中,则超结瘤现象受到明显的限制。采用nts 382植株地上部做接穗嫁接到Bragg砧木上,这个嫁接体仍表现为超结瘤型,对换接穗和沾木位置后的嫁接体则表现为野生亲本型。Bragg抽提液对nts 382植株超结瘤的抑制性还随所用豆苗生长期延长而明显减弱,接种后60天的植株抽提液基本无效。未接种的Bragg豆苗抽提液不能抑制nts 382的超结瘤。与此相反的是在嫁接实验中不存在这个时间效应,无论用Bragg幼苗或较为成熟的植株做接穗,都能有效地抑制nts 382砧木上的超结瘤现象。

植物基因工程的现状、前景及问题

近几年来植物基因工程的研究进展十分迅速。在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改变植物的某些成份方面都已得到不少转基因植株,有的已经建成了品系;为提高作物的产量、抗逆能力、改进它们的品质,进行快速、优质、稳产的良种选育提供了一条全新的诱人的途径。作为生物技术的一个重要部分,植物基因工程的研究和开发利用巳被列入我国新技术研究计划之内。目前,植物基因工程技术研究中的首批成果已经接近或初步进入了开发利用的阶段。这一阶段中又会有一些新的问题,例如,外源基因在转基因植物品系、品种中的遗传稳定性如何。转基因植物可能造成的农业污染等问题,都需要研究。本综述除着重于介绍植物基因工程研究中的一些最新成果外,同时根据本实验室的一些工作经验,提出了在我国植物基因工程研究的发展中应注意的一些问题。

芽孢杆菌原生质体的形成、再生及种间融合的研究

原生质体融合技术不仅能使遗传基因高频率重组,而且可以集双亲优良遗传性状为一体.自Schaeffer等人成功地进行了微生物原生质体融合以来,这项技术便广为人们所接受.枯草芽孢杆菌分泌的抗菌蛋白能抑制多种植物病原菌的生长,苏云金芽孢杆菌生成的伴孢晶体蛋白可毒杀植物害虫.利用原生质体融合技术将这两种芽孢杆菌抑菌杀虫的遗传特性融为一体,选育出防治植物病虫害的新一代生防菌株成为可能,有关这方面的研究国内外尚未见报道.本文报道了抗菌蛋白产生菌TG26-10和晶体蛋白产生菌AS1.904-17原生质体的形成,再生及种间融合的影响因素,为进一步筛选目的融合子提供基础.

BmNPV CP突变株基因文库的构建及多角体蛋白基因的分离

家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)属于杆状病毒科,基因组为双链环状 DNA,约130kb。由该病毒基因组编码的多角体蛋白在病毒感染的后期大量表达形成结晶,将病毒粒子包埋于其中,对病毒粒子起保护作用。多角体形态受病毒基因组控制。

抗菌蛋白LCⅢ的分离纯化及其部分特性

拮抗细菌Bacillus subtilis A014培养液上清经硫酸铵沉淀后,上CM52阳离子交换层析柱,分离出的峰Ⅲ具有对水稻自叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzea)特异性抑制活性。进一步用快速液桐色谱(FPLC)的Mono S层析柱纯化并命名为抗菌蛋白LCⅢ。此蛋白质的分子量约26915 Da,等电点为9.12。氨基酸组成分析表明富含甘氧酸、苏氨酸、丝氨酸,缺少脯氨酸。经Edman降解法测出N末端28个氨基酸残基。根据其部分序列用计算机检索NBRF蛋白质文库,与所收入的已知蛋白质没有显著的同源性,表明是一种新的功能蛋白质。

甜椒的离体再生及基因转化

本研究从我国的6个甜椒(Capsicum frutescens)栽培品种中筛选出'双丰'、'中椒二号','中椒三号'3个再生能力较强的基因型,以苗龄10-16天的子叶为外植体,经过芽诱导、芽伸长、根诱导、移入土壤四个步骤的离体培养,已获得能正常开花结实的再生植株。所有培养基以MS为基本培养基,附加不同种类不同浓度的植物激素。最适的芽诱导培养基为MS+4-6mg/L BA+0.5mg/L IAA,芽诱导率可达100%。诱导出的芽转入MS+2mg/L zeatin或2mg/L BA+1-2mg/L GA;的培养基上,可使芽伸长,伸长率为35%左右。已伸长的芽在生根培养基MS或MS+0.1-0.5mg/L NAA上生根后,转入土壤成为正常植株。以子叶为外植体,用叶盘法进行甜椒的基因转化工作,筛选出侵染性强的菌株C58和GV3111,并检测到GUS基因在甜椒子叶上的短期表达。在含50mg/L卡那霉素培养基上已获得抗性芽,进一步检测工作以及转移抗烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒基因的工作正在进行。

生物技术和植物基因工程

生物技术中的基因工程,近年来发展极为迅速,但过去多数报道偏重于微生物基因工程,《生物技术和植物基因工程》则对植物基因工程着重介绍,很有参考价值。

应用聚合酶链式反应扩增大豆花叶病毒 外壳蛋白基因及其序列分析

本文报道应用聚合酶链式反应(PCR)技术,在体外扩增大豆花叶病毒外壳蛋白基因及其克隆和序列分析的结果。大豆花叶病毒的 RNA 从纯化的病毒粒子中提取,经逆转录合成了cDNA 的第一条链。以此为模板,利用 PCR 技术,经30个循环的扩增,得到一个特异的0.8kb片段。克隆后,对此片段进行了限制性内切酶物理图谱的分析,并测定了其全序列。实验结果证明,作者克隆到的是一个完整的大豆花叶病毒外壳蛋白基因,其核苷酸序列与已发表的大豆花叶病毒 N 株的同源率为96%,编码氨基酸的同源率为96.3%。还对利用大豆花叶病毒外壳蛋白基因培育抗大豆花叶病毒的转基因大豆的可行性进行了讨论。