微生物铝毒和耐铝机制的研究现状

铝是地球上含量最为丰富的金属元素 ,在酸性条件下 ,主要以Al3+ 存在。Al3+ 作为一种严重的环境毒剂 ,已经在众多模式生物中所证明。近年来 ,许多生物学家已日益注意到铝毒和耐铝性在环境科学与生命科学领域的重要性。结合研究工作 ,综述了微生物铝毒害和耐铝的机制。微生物通过①增强分泌有机酸与Al3+ 螯合 ,②超表达Mg2 + 通道蛋白 ,增强细胞转运吸收Mg2 + ,③通过线粒体ATPase和液泡ATPase协同作用将Al3+ 隔离于液泡内 ,以及④通过氧化胁迫改变、调节Al3+ 毒害和耐铝性 ,减缓Al3+ 对细胞的毒害。

浙江省副溶血性弧菌污染水平及贝类海产品风险评估

目的在研究浙江省各类食品中副溶血性弧菌污染水平的基础上,进行贝类海产品副溶血性弧菌感染风险评估。方法对2 215件市售食品用科玛嘉弧菌显色培养基分离副溶血性弧菌,并用API 20E鉴定条鉴定;用Risk Ranger软件进行贝类海产品副溶血性弧菌感染风险评估;用PCR方法进行毒力基因检测。结果副溶血性弧菌检出率鲜(活)海水产品为43.06%、生/半生食海产品为32.52%、鲜活淡水产品为22.22%、生畜肉为13.52%、生禽肉为11.44%、散装熟肉制品为3.44%、中式凉拌菜为2.98%、生食蔬菜为2.10%、鲜奶蛋糕为2.08%。8月～10月副溶血性弧菌检出率显著高于4月～6月(P<0.01,χ2=46.445)。农贸市场采集的食品副溶血性弧菌检出率显著高于超市(P<0.01,χ2=10.252)。tdh毒力基因携带率为3.66%(3/82),trh基因全部阴性。生食或半生食牡蛎等贝类海产品副溶血性弧菌感染风险系数分别为50(生食)和48(半生食),每年因食用牡蛎等贝类海产品导致副溶血性弧菌食源性疾病的人数为4.42×104人(生食)和2.21×104人(半生食),如果烹饪彻底,风险系数降可至零。结论浙江省各类食品中副溶血性弧菌污染问题突出,防止食品间交叉污染,不生食半生食海水产品,即食食品食用前加热处理是减少副溶血性弧菌食源性疾病发生的最有效方法。

120株副溶血性弧菌的血清群和耐药性分析

目的:通过对副溶血性弧菌食物中毒菌株的血清群、耐药性检测,了解浙江省各类副溶血性弧菌主要血清群及耐药状况,为预防副溶血性弧菌食源性疾病发生,为指导临床合理用药提供依据。方法:用VITEK全自动微生物分析系统进行耐药性鉴定;血清学检测采用玻片凝集法。结果:我省副溶血性弧菌血清群主要为O3群、O4群、O1群、O5群。不同来源菌株间的血清型差异较大。从门诊病人和食物中毒事件中分离的菌株主要为O3群、O4群、O5群,从食品中分离的菌株主要为O1群、O10群、O2群、O11群。对头孢呋辛新酯、头孢呋辛、头孢噻吩和头孢唑啉有极高的耐药率,均在50%以上;对胺苄西林、羧卡西林、阿莫西林/克拉维酸的耐药性分别为49.17%、43.33%、32.50%;对头孢曲松、环丙沙星、庆大霉素、米若环素、萘啶酸、呋喃妥因、诺氟沙星、氧氟沙星、替卡西林/棒酸、妥布霉素、复方新诺明11种抗生素完全敏感。结论:要重点防治由O3群、O4群血清型的耐7种抗生素的超级耐药株引起的副溶血性弧菌食源性疾病或食物中毒。

浙江省首次检出1株携带NDM-1基因的肺炎克雷伯菌

目的对浙江省不同地区上送的临床分离株进行NDM-1基因筛检,初探浙江省NDM-1基因携带菌阳性菌存在现状。方法应用TaqMan-MGB荧光定量PCR方法对2013年度收集的所有临床株进行NDM-1基因筛检;利用普通PCR方法对阳性株进行NDM-1基因测序、MLST分型及其它30种耐药基因检测;使用VITEK 2Compact高级专家系统对阳性株进行微生物鉴定与耐药表型MIC测试;采用改良Hodge实验及亚胺培南-EDTA双纸片法协同试验,分别对阳性株进行碳青霉烯酶及金属β-内酰胺酶检测。结果经对1 450株菌株进行筛检,仅从1株来自疑似病毒腹泻11月大幼儿患者粪便中分离的肺炎克雷伯菌中检出该基因,基因序列同源性为100%,该菌MLST序列型为ST1416,产碳青霉烯酶及金属β-内酰胺酶,对Levofloxacin、Trimethoprim/Sulfa敏感,对Ciprofloxacin中敏,但对其他18种所检药物均显示耐药,另携带SHV、CTX、DHA、TEM、CMY2、IMP、GES、GIM、OXA-48、SPM、AmpC、aadA1、aacA4、aphA1共14种耐药基因,结果表明该菌株的耐药表型与基因型较为符合。结论本次从肠杆菌科肺炎克雷伯菌中检出NDM-1基因,应为浙江省首次报道,鉴于肠杆菌科细菌耐药速率传播更快,警示相关部门应重视并加强对NDM-1基因携带菌的监测与筛查。

浙江省369份淡、海水鱼香港海鸥型菌污染状况研究

目的掌握浙江省淡、海水鱼中香港海鸥型菌污染状况,为防止食源性香港海鸥型菌病的发生和流行提供科学依据。方法用改良头孢哌酮麦康凯琼脂分离,API20NE鉴定香港海鸥型菌。K-B纸片扩散法作耐药性测定。通用引物扩增16SrDNA并与香港海鸥型菌HKU1株开展同源性比较。结果369份样品检出香港海鸥型菌18株,阳性率为4.88%,其中,鲤鱼检出率为25.00%,草鱼的阳性率为10.26%,海水鱼以及鲫鱼、鲢鱼、扁鱼等淡水鱼中未分离出。分离的香港海鸥型菌16SrDNA序列与HKU1株仅相差1～2个碱基,同源性在99.6%～100.0%之间;18株菌对头孢拉定、万古霉素、甲硝唑、克林霉素、头孢哌酮完全耐药,对红霉素、亚胺培南、克拉霉素、氨曲南、庆大霉素、丁胺卡那霉素、三甲氧苄氨嘧啶、四环素、氯霉素、多粘菌素B、环丙沙星完全敏感,对头孢噻吩、胺苄西林、头孢曲松的耐药性分别为83.33%、61.11%和5.56%。结论浙江省存在香港海鸥型菌污染源,建议相关监督部门应加大这类产品的管理力度,防止香港海鸥型菌病在我省的发生和传播。

食品中沙门菌污染状况及耐药性研究

目的：了解浙江省食品中沙门菌的污染状况和耐药水平。方法：根据GB4789．4—94进行沙门菌的分离鉴定；用VITEK微生物分析系统GNS121药敏卡片测定沙门菌的耐药性。结果：从1047份生肉、生奶、生水产品和生食蔬菜中分离到74株沙门菌，总阳性率为7．07％。主要血清型为德尔卑沙门菌、鼠伤寒沙门菌和圣保罗沙门菌。对其中66株沙门菌的耐药性测定结果表明，对1种以上的抗生素敏感的沙门菌占51．52％，对5种以上抗生素耐药的多重耐药株占7．58％。在15种药敏试剂中，对呋喃妥因、安苄西林、哌拉西彬他唑巴坦、阿莫西彬克拉维酸和妥布霉素的耐药性达33．33％、16．67％、12．12％、9．09％和9．09％；对环丙沙星、庆大霉素和复方新诺明存在一定的耐药菌株（约达5％-8％）；所有菌株对丁氨卡那霉素、头孢曲松、头孢替坦、头孢他啶和亚胺培南均敏感。结论：与2001年所测菌株的耐药性相比，被测菌株的耐药性有所增强，耐药谱有所变宽。

香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术研究

目的利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便、快速、特异、灵敏的香港海鸥型菌检测方法。方法根据香港海鸥型菌16SrDNA的保守区域设计特异性引物和探针。用不同浓度、不同温度对反应体系引物浓度、探针浓度及退火温度进行优化。用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性;用香港海鸥型菌以及大肠杆菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性。结果当25μL反应体系中上、下游引物(10μmol/L)各为0.6μL,探针(10μmol/L)为0.4μL,模板DNA量为5.0μL,反应条件:预变性95℃20s,变性95℃10s,退火57℃40s,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct=-3.538×log(菌浓度)+13.56,r=0.999],方法的最低检测浓度达到36cfu/mL。23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线。隔天连续5d重复试验Ct值变异系数小于3。20件活鲤鱼、18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P<0.01,χ2=21.50)。且后者所需时间为5d,前者仅需10h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便、特异性强、灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用。

一起O3∶K6型副溶血性弧菌引起的食物中毒病原学检测

目的检测食物中毒患者粪便或肛拭子、剩余食物、调味品、食物加工环节涂抹物分离的病原菌的生物学特性,确定食物中毒的病原。方法参照GB/T4789-2003方法,对检出的副溶血性弧菌(VP)做血清分型、耐药性、种属特异基因和毒力基因[tdh(耐热溶血素)和trh(耐热相关溶血素)]检测。结果从153份粪便或肛拭子样品中检出74株VP,并从调味品和加工环节涂抹物及垃圾桶内的剩余食物(猪头肉)中各检出1株VP,血清型均为O3∶K6型,神奈川溶血阳性(KP),77株VP聚合酶链反应(PCR)扩增都出现相同VP种属特异基因(320bp)条带,77株副VP毒力基因复合PCR结果,tdh(434bp)阳性,trh(250bp)阴性。结论本次食物中毒是由具较强毒力的O3∶K6型VP污染引起的。

海藻糖在提高酿酒酵母细胞耐铝性中的作用

海藻糖是一种由两个葡萄糖分子通过,α-α1,1糖苷键连接的非还原性双糖,广泛存在于微生物、动物和植物体内,对生物大分子的活性具有良好的保护效果,对生物体抗逆性起着重要作用。铝是地壳中含量最为丰富的金属元素,是一种严重的环境毒剂,在酸性环境中,对生物生长有重要影响。本文采用酿酒酵母菌株LK及其耐铝突变株LKt,分析它们胞内海藻糖含量的差异,研究铝胁迫下胞内海藻糖的变化。研究结果表明海藻糖含量的提高可明显增加酵母细胞在铝胁迫时的存活率。耐铝突变株LKt在铝胁迫下诱导产生海藻糖的能力显著高于原始菌株LK;酿酒酵母菌株中海藻糖诱导合成积累含量与其耐铝性存在密切正关系,是酵母主要耐铝机制之一。

浙江省结核分枝杆菌耐药突变特征及其与基因型相关性分析

目的:评价全基因组测序(whole-genome sequencing,WGS)对浙江省结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药相关基因突变特征及其与基因型相关性的耐药分析和检测效能。方法:对2018—2019年浙江省第五次结核病耐药监测项目收集的808株MTB菌株进行14种抗结核药物的WGS分析。鉴定菌株的基因型及耐药相关基因突变,并对二者相关性,以及WGS检测异烟肼的药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果与表型药敏试验结果的一致性进行分析。结果:808株MTB菌株中,153株对11种抗结核药物(异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、链霉素、氟喹诺酮类、阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸)发生了耐药相关基因突变,总突变率为18.9%。主要耐药突变类型分别为katG-315-S/T[异烟肼,60.0%(45/75)]、rpoB-450-S/L[利福平,57.1%(16/28)]、embB-306-M/V[乙胺丁醇,43.8%(7/16)]、rpsL-43-K/R[链霉素,65.5%(36/55)]、gyrA-94-D/G[氟喹诺酮类,36.6%(15/41)]、rrs-1402-C/A(阿米卡星,3/3)、rrs-1402-C/A(卡那霉素,3/4)、rrs-1402-C/A(卷曲霉素,3/3)、inhA-15-C/T[乙硫异烟胺,65.0%(13/20)]、thyA-75-H/N(对氨基水杨酸,7/8)。rpsL基因和katG-315位点在北京基因型中的耐药突变率[均为6.8%(40/586)]均明显高于二者在非北京基因型中的突变率[0.0%(0/222)和3.2%(7/222)],差异均有统计学意义(χ^(2)=15.943,P=0.000;χ^(2)=3.964,P=0.046)。WGS耐药性分析对于异烟肼的检测敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率和Kappa值分别为87.5%(49/56)、98.0%(680/694)、77.8%(49/63)、99.0%(680/687)、97.2%(729/750)和0.808。结论:浙江省MTB菌株对11种抗结核药物耐药相关基因突变以katG、rpoB、embB、pncA、rpsL、gyrA、rrs、thyA、inhA基因上的突变为主,其中rpsL基因、katG-315和rpsL-43位点突变与北京基因型相关。WGS耐药性分析对于异烟肼具有全面的耐药检测性能,但对个别基因突变位点的检测性能较弱。

贝达喹啉耐药分子机制研究进展

耐药性结核病已逐渐成为全球性公共卫生问题并引起全世界广泛重视。贝达喹啉作为一种新型抗结核药物, 对耐药性结核病具有显著的治疗效果。然而, 自2014年德国报告了首例贝达喹啉耐药患者后, 其耐药情况逐渐增多。本文综述了贝达喹啉的抗菌特性、作用机制和耐药性分子机制, 并探讨如何避免贝达喹啉耐药性的发生、延缓贝达喹啉耐药性的进展。

2009年杭州市市售虾中创伤弧菌的定量检测及其基因分型

近年来,浙江省因弧菌引发的食源性疾病问题日益突出,每年因进食海水产品引起的病例占了较大比例.创伤弧菌是一种带荚膜的革兰阴性嗜盐弧菌,存在于虾、牡蛎、鱼等海产品中,进食被创伤弧菌污染海产品而引起的食物中毒是最为严重的食源性疾病之一,其致死率可高达50%～60%[1],近年来我省也报道了由创伤弧菌导致的散发致死病例[2-3].在日本和我国上海、广州等地的市场上,虾中创伤弧菌存在较高的阳性检出率[4],因此创伤弧菌被认为是虾食用者的一种健康威胁,为了解杭州市虾中创伤弧菌的污染情况及其致病基因型别,笔者于2009年7-8月对杭州市市售虾中的创伤弧菌进行调查监测.

腹泻样本中创伤弧菌的检测分析

目的了解浙江省部分地区腹泻患者创伤弧菌的感染情况。方法对2010年6-10月采集的标本,经3%氯化钠碱性蛋白胨水于37℃增菌后,划线纤维二糖多粘菌素E平板于40℃培养18～24 h,挑取可疑菌落进行分子生物学鉴定。结果在144份腹泻患者粪便样本中检测分离到2株创伤弧菌,阳性率为1.39%(2/144);均为生物Ⅰ型,其基因型为vcgC/16S rRNA B型。药敏结果显示分离的创伤弧菌对氨基糖苷类抗生素耐药如阿米卡星、庆大霉素。结论在监测的腹泻样本中分离到具有较强致病能力的创伤弧菌,且氨基糖苷类抗生素耐药,应加强对海水产品和腹泻样本中创伤弧菌的检测及耐药分析,预防创伤弧菌的感染暴发。

舟山市售牡蛎中创伤弧菌污染的定量分析

目的:了解舟山市场上牡蛎中创伤弧菌污染状况,为预防创伤弧菌引起的食源性疾病做好预警,并对食用牡蛎的安全性评估提供科学依据。方法:从2007年7月至2008年6月分四次先后分别在舟山定海西码头和嵊泗县定海南珍菜场等农贸市场共采集40份牡蛎样本,经碱性蛋白胨水增菌,选择性培养基筛选培养,并通过生化鉴定、核酸检测进行定量检测分析。结果:在22份牡蛎样本中检出创伤弧菌,阳性率为55%,平均MPN值和最高MPN值分别为686.72 MPN/g和4600 MPN/g。结论:舟山市售牡蛎中创伤弧菌的污染情况严重,需对牡蛎的食品安全进行风险性评估,预防因生食牡蛎而导致的食源性疾病的暴发。

实时荧光定量PCR快速检测创伤弧菌的研究

目的:建立一套在8 h内检测牡蛎中创伤弧菌的实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏度和准确性等指标进行评价。方法:对经过或未经过3%NaCl碱性蛋白胨水5 h预增菌的样品分别采用两种DNA提取方法(QIAampDNA mini Kit和直接煮沸裂解法)提取DNA,并采用根据vvhA基因序列设计的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测。结果:所建立的实时荧光定量PCR特异性强,仅对创伤弧菌呈阳性结果。对预增菌5 h后经QIAamp DNA mini Kit提取的DNA进行实时荧光定量PCR检测,其检测效果最佳,灵敏度达1.4 cfu/ml。结论:所建立的实时荧光定量PCR方法具有快速、特异性强、敏感高等特点,能在8h内完成在牡蛎等海产品中创伤弧菌的快速检测。

一株死亡患者分离的致死创伤弧菌菌株的耐药表型与分子特征

目的对培养分离的创伤弧菌菌株(2014-DJH)进行耐药表型与分子特征分析。方法采用全自动微生物鉴定及药敏分析系统进行生化鉴定和耐药分析;采用PCR方法检测vvh A基因和pil F基因,及vcg和16S rRNA基因分型;应用多位点序列分析进行分子分型。结果分离菌株2014-DJH经生化鉴定为革兰阴性的生物1型创伤弧菌;对大多数常用抗生素都敏感,对妥布霉素中度敏感;PCR检测vvh A和pil F阳性,为vcg C-16S rRNA B(CB)基因型;菌株的多位点序列型为glp 5、gyr B 3、mdh 32、met G 68、pur M 21、dtd S 39、lys A 115、pnt A 4、pyr C 42、tna A 75。结论菌株2014-DJH为新ST型菌株,命名为ST 289,注册号为id-389。基因分型结果表明该菌具有较强的致病能力,加强创伤弧菌感染的监测与预警具有重要的意义。

浙江省2002-2018年病毒性脑膜炎病原学与分子流行病学特征

目的了解2002-2018年浙江省病毒性脑膜炎病原学及分子流行病学特征。方法从设立的监测点医院采集疑似病毒性脑膜炎患者样本2173份,其中脑脊液1718份、粪便455份,用荧光定量PCR方法检测脑脊液中人类肠道病毒(HEV)、腮腺炎病毒(MuV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)和乙型脑炎病毒(JEV)核酸,粪便样本只检测HEV;用ELISA方法检测脑脊液中上述5种病毒IgM抗体;对HEV核酸阳性样本扩增病毒VP1基因和测序,确定病毒型别并进行进化分析。结果在2002-2018年2173份样本中检出HEV核酸阳性871份(40.1%),其中脑脊液1718份、阳性654份(38.1%),粪便455份、阳性217份(47.7%);871份HEV核酸阳性样本,VP1扩增测序阳性670份,其中HEV-A 5份、HEV-B 665份,涉及23个病毒血清型,分别为柯萨奇病毒(CV)A组CVA4、CVA6、CVA9、CVA10,CVB组1~5,埃可病毒(EchoV;E)E3、E4、E6、E7、E9、E11、E14、E16、E18、E21、E25、E30、E33和肠道病毒(EV)-71,位于前3位的分别为E30、E6和CVB5,该3个血清型间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势。从2012-2015和2018年795份脑脊液中检出HEV核酸阳性374份、MuV 6份、HSV和CMV均为5份,对其中的368份脑脊液同时检测5种病毒IgM抗体,HEV抗体阳性2份、JEV 6份、MuV 1份。670份HEV中除1份EV-71外,EchoV 517份、CV 152份,两者之比为3.4∶1,两类病毒间隔3~5年存在优势株交替变化的趋势。VP1进化树显示,浙江省HEV位于HEV-A和HEV-B分支上,E30存在h和i基因亚型。结论浙江省病毒性脑膜炎的主要病原为HEV-B;EchoV检出率明显高于CV,两类病毒存在交替变化的趋势;优势血清型E30、CVB5和E6间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势;监测点HEV活动强度与病毒性脑膜炎暴发疫情的发生两者之间在时间上有较好的相关性。

应用高通量测序技术快速鉴定未分型甲型流感病毒

目的利用Ion Torrent半导体二代测序技术开展禽类和外环境中禽流感病毒基因组测序和亚型的快速鉴定，建立快速豁定未分型甲型流感病毒亚型的高通量测序厅法。方法提取9份禽类拭子和外环境标本中的病毒RNA，进行甲型流感病毒通用型、H5N1亚型、H7N9亚型和H9N2业型荧光定量PCR检测；利用PathAmpFluA试剂盒对病毒RNA进行全基因组扩增，利用Next Fast DNA Fragmentation＆Library Prep Set low Ion Torrent试剂盒进行义库制备，并存Ion torrent二代测序仪上完成测序；采用Ion Torrent Suitev3．0进行测序数据提取和质量评估，并且用Flu Atyping v4．0和PathogenAnalyzer两个捕件进行流感序列拼接和数据库比对，最终确定9份禽流感标本的流感病毒业型。结果9份禽类拭子和外环境标本甲型流感病毒核酸阳性但常规监测的H5N1、H7N9和H9N2亚型均为阴性，经二代测序和生物信息学分析共鉴定出7种亚型：H2N3、H5N6、H5N8、H7N1、H7N7、H11N3业型流感病毒阳性标本各1个，H6N6亚型流感病毒阳性标本3个。结论浙江省外环境中禽流感病毒亚型众多，Ion torrent半导体测序技术适用于禽及外环境监测巾发现的末分型甲型流感病毒业型的快速鉴定。

浙江省209株沙门菌PFGE指纹图谱研究

目的：建立浙江省沙门菌PFGE指纹图谱资料库,为查明沙门菌食源性疾病污染源,确定各病例之间的病原学关系,及时处理大范围内呈散发特征的沙门菌事件提供科学依据。方法：收集、提取全省历年来在各类食品和腹泻病人中分离的209株沙门菌的DNA,用限制性内切酶Xbal切割,脉冲场凝胶电泳（PFGE）技术建立PFGE指纹图谱,用BioNu-merics V5.1软件UPGMA方法进行聚类分析。结果：209株沙门菌分成10个基因型别160种PFGE基因指纹图谱。其中67株德尔卑沙门菌可分为6个型别35种PFGE指纹图谱,主要集中在1个PFGE指纹图谱型别中。14株肠炎沙门菌分属3个型别8种PFGE指纹图谱,相似系数在0.800-1.000之间。鼠伤寒沙门菌间的PFGE指纹图谱差异较大。结论：PFGE指纹图谱与血清学型别无相关性,该方法在研究沙门菌分子流行病学、确定各病例之间的病原学关系效果良好。