地塞米松对大鼠成骨细胞功能及蛋白激酶B磷酸化的影响

目的研究地塞米松(dexamethasone,Dex)对大鼠成骨细胞功能及Akt磷酸化的影响。方法取新生SD大鼠颅骨体外分离培养的成骨细胞,根据地塞米松作用浓度分为对照组(0 mol/L Dex)、10^(-8)mol/L Dex组、10^(-7)mol/L Dex组、10^(-6)mol/L Dex组干预24 h;应用Akt激动剂SC79进一步验证地塞米松对成骨细胞增生和功能的影响,分为对照组(0 mol/L Dex,0 mol/L SC79)、SC79组(0 mol/L Dex,10μmol/L SC79)、Dex组(10^(-6)mol/L Dex,0 mol/L SC79)、SC79+Dex组(10μmol/L SC79,10^(-6)mol/L Dex)干预24 h。培养结束后,运用Cell Counting Kit-8法检测细胞增生活力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测成骨细胞上清液中ALP的含量,Western blot法检测成骨细胞中ALP、Akt、p-Akt蛋白表达。结果 (1)与对照组相比,10^(-7)mol/L、10^(-6)mol/L Dex组的细胞增生活性均明显下降(A值分别为0.742±0.022、0.598±0.028、0.570±0.025),差异有统计学意义(P<0.05)。10^(-8)mol/L地塞米松对成骨细胞增生抑制不明显(P>0.05);(2)除10^(-8)mol/L Dex组外,10^(-7)mol/L Dex组、10^(-6)mol/L Dex组上清液中ALP含量均显著低于对照组(ALP活性值分别为0.316±0.015、0.313±0.013、0.351±0.028),差异有统计学意义(P<0.05);(3)在10^(-8)mol/L、10^(-7)mol/L、10^(-6)mol/L地塞米松作用下,成骨细胞p-Akt蛋白表达较对照组分别减少16.9%、34.9%、62.5%,差异有统计学意义(均P<0.05),ALP蛋白分别减少16.2%、24.8%、69.3%,其中10^(-7)mol/L Dex组、10^(-6)mol/L Dex组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);(4)与对照组相比,10μmol/L SC79刺激p-Akt蛋白的表达,对ALP蛋白的表达具有促进作用(P<0.05);与Dex组相比,SC79+Dex组成骨细胞增生活力及ALP活性明显升高,p-Akt、ALP蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论高浓度地塞米松可以抑制成骨细胞增生和ALP的表达,其作用机制可能与下调Akt磷酸化有关。

酶消化法联合组织块法培养大鼠原代成骨细胞

背景:获取高纯度、高活性的成骨细胞是进行骨代谢研究的基础。目的:探索一种简便、高效的原代成骨细胞培养方法。方法:将新生24 h内的SD大鼠,分离获取颅骨的顶骨和额骨,预先采取胰酶和胶原酶消化,再进行组织块培养的方法提取成骨细胞。通过倒置相差显微镜和透射电镜观察细胞形态,细胞计数绘制细胞生长曲线,采用碱性磷酸酶BCIP/NBT染色和茜素红矿化结节染色进行成骨细胞鉴定。结果与结论:(1)细胞形态呈长梭形、三角形、不规则多边形,有两至三个细胞突起;(2)透射电镜下线粒体和内质网在成骨细胞中非常丰富,并且有较多细胞突起,呈现出典型成骨细胞特点;(3)细胞刚接种时生长缓慢,3 d后增殖加快,第7天达高峰;(4)碱性磷酸酶BCIP/NBT染色显著阳性,茜素红钙结节染色橘红色;(5)采用酶消化法联合组织块法提取的细胞具有典型的成骨细胞特征和功能,是一种理想的原代成骨细胞分离培养方法。

地塞米松通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡的研究

目的观察地塞米松对离体成骨细胞凋亡的影响,探讨地塞米松对成骨细胞凋亡的分子作用机制。方法采用不同浓度地塞米松(10^(-8)、10^(-6)、10^(-4)mol/L)干预SD大鼠离体成骨细胞,DAPI染色观察细胞核形态,透射电镜观察细胞核及线粒体形态,流式细胞术检测细胞凋亡率,JC-1荧光探针检测线粒体跨膜电位。结果 10^(-8)、10^(-6)、10^(-4)mol/L地塞米松干预24 h后,DAPI染色发现,10^(-8)mol/L地塞米松组的成骨细胞很少发生凋亡,10^(-6)mol/L和10^(-4)mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡明显,地塞米松的浓度越高,核固缩、核裂解等凋亡现象越明显;透射电镜观察发现,随着地塞米松浓度增加,细胞核固缩明显,线粒体肿胀、空泡样变化现象增多;成骨细胞的凋亡率随着地塞米松浓度的增加而逐渐增高,与空白对照组相比,10^(-8)mol/L地塞米松组细胞凋亡率无明显升高(P>0.05),10^(-6) mol/L和10^(-4)mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡率分别较空白对照组增加7.240%和31.173%(P<0.05);随着地塞米松浓度的增加,线粒体膜电位逐渐减低,与空白对照组相比较,10^(-8)mol/L地塞米松组细胞膜电位下降不明显(P>0.05),10^(-6) mol/L和10^(-4)mol/L地塞米松组膜电位下降分别较空白对照组降低6.814%和17.846%(P<0.05)。结论地塞米松通过激活线粒体途径诱导成骨细胞凋亡,存在浓度依赖性。

不同剂量和作用时间地塞米松对大鼠骨密度和成骨细胞作用的研究

目的观察地塞米松(Dex)不同剂量及不同作用时间对大鼠骨量、成骨细胞的影响。方法 120只3月龄SD雌性大鼠,随机分对照组(生理盐水)、小剂量组(地塞米松1 mg/kg)、中剂量组(地塞米松2.5 mg/kg)、高剂量组(地塞米松5 mg/kg),每组30只,2次/周肌内注射,分别干预4 w、9 w、12 w。给药前及干预后采用双能X线骨密度仪测大鼠全身骨密度(BMD),免疫组化法检测骨组织碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原蛋白表达。从新生SD大鼠颅骨体外分离培养成骨细胞,随机分为5组:空白对照组、5×10-8mol/L Dex组、5×10-7mol/L Dex组、5×10-6mol/L Dex组、5×10-5mol/L Dex组,分别培养12h、24 h、48 h后,采用CCK8法检测成骨细胞增殖,采用RT-PCR检测成骨细胞ALP mRNA、I型胶原mRNA表达。结果 (1)干预4 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度与对照组无差异(P>0.05)。干预9 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P<0.05),高剂量组大鼠骨密度低于小剂量组(P<0.05);干预12 w,不同剂量Dex组大鼠的骨密度均低于对照组(P<0.05),且随着剂量的增加,大鼠的骨密度逐渐降低。(2)干预4 w,ALP、I型胶原蛋白表达与对照组无差异(P>0.05);干预9w,中剂量和高剂量组大鼠骨组织I型胶原蛋白表达均低于对照组(P<0.05),不同剂量组大鼠骨组织ALP蛋白表达均低于对照组(P<0.05);干预12 w,大鼠骨组织ALP、I型胶原蛋白表达均低于对照组(P<0.05);随着Dex剂量的增加,大鼠骨组织ALP及I型胶原蛋白表达逐渐降低。(3)体外分离培养成骨细胞干预12 h,5×10-6mol/L Dex和5×10-5mol/L Dex均抑制成骨细胞增殖(P<0.05),5×10-5mol/L Dex组成骨细胞的ALP、I型胶原mRNA表达减少(P<0.05);干预24 h及48 h,不同浓度Dex均明显抑制成骨细胞增殖(P<0.05),ALP、I型胶原mRNA表达明显减少(P<0.05),呈剂量和时间依赖性。结论地塞米松可能通过抑制成骨细胞的增殖及骨形成,导致SD大鼠骨密度降低。

地塞米松诱导体外培养成骨细胞凋亡作用机制的研究

目的研究地塞米松对体外培养的成骨细胞增殖和凋亡的影响，及其可能的作用机制。 方法体外分离培养SD大鼠成骨细胞，观察细胞形态，应用碱性磷酸酶染色法和茜素红染色法鉴定成骨细胞。取1~3代对数生长期细胞，分为空白对照组、低剂量地塞米松组（10-8 mol/L）、中剂量地塞米松组（10-7 mol/L）、高剂量地塞米松组（10-6 mol/L），分别干预12、24、48 h，运用Cell Counting Kit-8法检测细胞增殖情况，采用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率，免疫荧光法观察细胞核的形态和caspase-3的表达，蛋白质印迹法检测Bcl-2、Bad、caspase-3、磷酸化Akt的表达。采用单因素方差分析，两两比较方差齐采用LSD-t法进行统计分析。 结果10-8 mol/L、10-7 mol/L、10-6 mol/L地塞米松能抑制成骨细胞增殖，以48 h最为明显（A值分别为：0.980±0.028，0.798±0.057，0.728±0.031），与空白对照组（1.143±0.017）相比，差异有统计学意义（t=5.454，11.555，13.908；P均〈0.05）；不同浓度地塞米松干预48 h后，成骨细胞凋亡率逐渐升高。与空白对照组[（4.1±0.8）%]相比，10-8 mol/L地塞米松组细胞凋亡率[（4.9±1.2）%]升高差异无统计学意义（t=0.470，P〉0.05），10-7 mol/L、10-6 mol/L地塞米松组的成骨细胞凋亡率分别为（9.8± 2.6）%、（12.4±2.6）%，呈显著性升高（t=3.508，5.140，P均〈0.05）；免疫荧光检测结果显示，不同时间地塞米松作用后，成骨细胞caspase-3表达逐渐增强，其中10-7 mol/L、10-6 mol/L地塞米松组的caspase-3表达显著增加（t=4.320，t=8.475；P〈0.05）；蛋白质印迹法检测结果显示，地塞米松干预浓度为10-7 mol/L和10-6 mol/L时，Bcl-2蛋白表达分别较空白对照组减少53.8%、78.4%（t=4.109，5.988；P〈0.05），p-Akt蛋白表达分别减少37%、49.6%（t=2.067，3.491；P〈0.05），Bad蛋白表达分别增加276.9%、334.8%（t=7.342，8.872；P〈0.05），caspase-3蛋白表达分别增加138.0%、193.9%（t=5.510，7.750；P〈0.05）。 结论地塞米松可能通过抑制PI3K/Akt信号通路，抑制Bcl-2的表达，并上调Bad、caspase-3的表达导致成骨细胞的增殖减少，凋亡增加。