国产第一代β-hCG避孕疫苗免疫恒河猴的抗体反应及免疫安全性研究

用国产第一代ｈＣＧ避孕疫苗（以β－ｈＣＧ－ＴＴ为免疫原制备的氢氧化铝吸附制剂）免疫成年雌性恒河猴，评价疫苗在实验猴体内诱发抗ｈＣＧ抗体的能力和免疫安全性．结果显示疫苗能在实验猴诱发抗ｈＣＧ抗体，但抗体滴度较低（峰滴度为１４０００），持续时间较短，加入Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ佐剂免疫能显著增强动物的抗体反应（峰滴度可达１６４０００），免疫猴对强化免疫有较好的记忆反应．免疫前后各免疫猴血液红细胞数、血红蛋白含量、白细胞数、白细胞分类计数均未见异常，血清谷丙转氨酶、总蛋白、白蛋白等肝脏功能指标也未见异常．免疫猴心、肝、肾、脾、胰腺、腺垂体、卵巢、子宫等器官未发现组织病理学改变．．

人类绒毛膜促性腺激素避孕疫苗的毒理学和免疫安全性研究

3种hCG疫苗(A.β-hCG二聚体、B.β-hCG CT 37肽TT偶合物、C.酶切β-hCG肽段)免疫雌性恒河猴进行毒理学和免疫安全性研究。血液分析结果表明,免疫前后动物血液红细胞数、血红蛋白含量、白细胞数、红细胞沉降速度等血液指标和血清麝香草酚浊度、硫酸锌浊度、黄疸指数等肝功能指标没有显著的差异(P>0.01),免疫后血清谷丙转氨酶虽比免疫前低(P<0.05),但没有临床意义。免疫后血液淋巴细胞水平显著高于免疫前(P<0.01)。组织病理学观察显示除对注射部位肌肉有明显刺激外,3种疫苗免疫对心、肝、肾、睥、胰腺、子宫、卵巢、垂体等器官无特异的组织损伤。免疫荧光分析结果表明抗血清不与猴心、肝、肾、脾、胰腺、子宫、卵巢、垂体和肌肉等组织交叉反应。电镜观察未见疫苗免疫引起肾小球基膜的损害。

去糖基猪卵透明带抗原DGZPB和DGZPC的分离纯化及免疫特性

目的 :为发展避孕疫苗研究制备去糖基猪卵透明带抗原DGZPB和DGZPC并研究它们的免疫反应性。方法 :从阉割小母猪采集的猪卵巢分离猪卵透明带 ,经热溶解 ,SephacrylS - 4 0 0和HTP柱层析分离纯化抗原ZP3,经 β -半乳糖苷酶消化 ,用反相HPLC分离得部分去糖基的pZPB和pZPC ,再用TFMS处理 ,制备去糖基猪卵透明带抗原DGZPB和DGZPC。以MDP为佐剂 ,用DGZPB和DGZPC分别免疫家兔。用ELISA法测定抗血清与ZP3、DGZPB和DGZPC的反应。结果 :用反相HPLC分离 β -半乳糖苷酶处理的ZP3,得部分去糖基Mr 为 4 .6× 10 4 的pZPB和Mr 为 4 2× 10 4 的pZPC ,用TFMS对部分去糖基pZPB和pZPC作化学去糖基分别得Mr 为 3 7× 10 4 的DGZPB和Mr 为3 2× 10 4 的DGZPC。DGZPB和DGZPC免疫家兔均能诱发抗体反应 ,抗DGZPB抗血清和抗DGZPC抗血清能与ZP3反应。但两种抗血清不发生交叉反应。结论 :从猪卵巢可分离制备的去糖基卵透明带抗原DGZPB和DGZPC ,用于免疫诱发的两种抗血清均能与ZP3反应 ,但两种抗血清无交叉反应。

用猪卵透明带55KDa糖蛋白抗原（ZP3）免疫恒河猴的初步研究

用猪卵透明带５５ＫＤａ糖蛋白抗原（ＺＰ３）和胞壁酰肢二肽佐剂（ＭＤＰ）免疫３只雌性恒河猴，研究猪ＺＰ３免疫的抗生育作用及其对卵巢正常结构与功能的影响，评价用恒河猴作卵透明带生育调节疫苗研究动物模型的合适性。实验观察持续４４０天，三只免疫猴中，两只产生高滴度抗ＺＰ３抗体并导致不孕（免疫组怀孕率为３３％，对照组为８０％）．血清Ｅ＿２和Ｐ测定结果表明，抗体滴度高的两只猴Ｅ＿２和Ｐ的水平极低，且不呈周期性变化，组织学观察表明两只不孕猴的卵巢缺乏生长卵泡和成熟卵泡，揭示ＺＰ３免疫阻断了卵泡的发育，这些结果与用猪ＺＰ３免疫其它灵长类动物报导的相似，它进一步证实ＺＰ３免疫的抗生育作用，并支持用恒河猴作动物模型，研究用合成肽段或基因重组产物作免疫原的卵透明带生育调节疫苗。

人类绒毛膜促性腺激素（hCG）避孕疫苗研究概况（综述）

人类绒毛膜促性腺激素（ｈＣＧ）避孕疫苗研究概况（综述）潘善培，刘学高（暨南大学生殖免疫研究中心，５１０６３２，广州）控制人口的过速增长、实行计划生育是我国的基本国策。发展安全、有效、使用方便、易为用者接受的避孕技术和方法是实施计划生育的重要保证。目前...

影响人类体外受精——胚胎移植成功率的某些因素分析

对137例采用hMG/hCG超排的IVF-ET的结果,分析比较了采卵时不同成熟度卵子的受精率、妊娠组与非妊娠组采卵时卵子的成熟度分布、采卵数、移植时胚胎发育阶段及移植胚胎数等差异。结果表明,采卵时成熟的卵子受精率较高,接近成熟卵子的受精率略低,未成熟卵子的受精率最低,仅达14％左右。妊娠组和非妊娠组卵子成熟度分布无显著差别(P>0.05),但妊娠组平均采卵数显著高于非妊娠组(P<0.01)。两组移植时胚胎发育阶段无显著差异(P>0.05),妊娠组可供移植胚胎数显著高于非妊娠组(P<0.01)。

人类体外受精及胎胚移植技术的研究和应用

人类体外受精及胚胎移植(In Vitro Fertilization and Embryo Tiansfer)是近十年来兴起的一项生殖工程技术,它是从体内采集配子,在体外受精并培育成早期卵裂阶段胚胎,再移植入母体子宫内发育成胎儿的,俗称试管婴儿技术,简称IVF-ET或IVF技术。 IVF—ET技术的诞生开创了人类生殖技术的新时代,是医学和生物学技术的一次伟大的革命。这项技术不仅为不孕患者提供了一种新的治疗方法。

重组人卵透明带ZP3蛋白在毕赤酵母中的表达

利用P .pastoris表达人卵透明带ZP3蛋白。设计特定引物从全长hZP3cDNA上扩增含跨膜区序列的人卵透明带ZP3基因片段 ,并在N末端接上串联组氨酸编码序列的重组基因序列 ;扩增片段插入表达载体pPIC9K中 ;线性化后的重组质粒转入P .pastoris中 ,用高浓度G4 18筛选高拷贝菌株 ,然后甲醇诱导目的蛋白表达。用SDS PAGE和Westernblot分析表达产物。结果发现P .pastoris表达的人ZP3蛋白可以分泌到培养液中 ,并且可溶性好。纯化前后的重组人ZP3蛋白均能与兔抗猪ZP3蛋白抗体发生交叉反应 ,证实表达的目的蛋白具有反应原性。

卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α的构建及其在体外的表达

目的:构建pVAX1-pZP3α,探讨其在体外的表达,研制卵透明带DNA避孕疫苗.方法:利用基因工程的方法构建卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α,用脂质体法转染Hela细胞并采用RT-PCR和Westernblot检测卵透明带抗原pZP3α的体外表达.结果:构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α,并在体外表达系统检测到卵透明带抗原pZP3αmRNA和pZP3α的表达.结论:正确构建了卵透明带DNA避孕疫苗pVAX1-pZP3α.

人精子顶体反应3种检测方法的比较与评价

目的:寻找简便和准确的精子顶体反应检测方法。方法:正常人精液标本液化后混合,分成6组,分别用金霉素染色法、考马斯亮蓝染色法和酸性磷酸酶检测法对孕酮诱导顶体反应前后的人精子进行形态学观察并且对顶体反应率进行数据统计。结果:经考马斯亮蓝和金霉素染色后,发生顶体反应的精子和没有发生顶体反应的精子均有明显的形态差异;经考马斯亮蓝染色、金霉素荧光染色和酸性磷酸酶测试法检验,孕酮诱导组与阴性对照组的精子顶体反应率均有明显差异(P<0.05)。结论:3种方法均可作为顶体反应的检测手段,但考马斯亮蓝染色更为简便和稳定。

重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽在毕赤酵母中的表达

目的:在巴斯德毕赤酵母中表达人巨细胞病毒gp52C末端和pp150C末端串联片段的嵌合肽.方法:用SacⅠ和BglⅡ分别酶切CMVp-pPIC9K重组质粒,电打孔法导入毕赤酵母GS115后,在缺组氨酸的MD板上筛选出转化子,然后根据甲醇利用快速型(Mut+)和甲醇利用缓慢型(Muts)菌株的不同生长特点,筛选出Mut+和Muts型转化子,用PCR法进一步鉴定阳性克隆.分别用甲醇诱导Mut+和Muts型转化子表达目的蛋白4d,取培养产物冻干浓缩,进行SDS-PAGE和Westernblotting,筛选出能特异表达目的蛋白的菌株,分析蛋白的含量及纯度.结果:重组人巨细胞病毒可在甲醇利用快速型毕赤酵母中有效表达,其表达量约占培养上清分泌蛋白的76 5%.结论:重组人巨细胞病毒(HCMV)嵌合肽可在真核细胞毕赤酵母中成功表达.

Galectin-3在雌性小鼠生殖系统中的表达及脂多糖的影响

目的:研究galectin-3在雌性小鼠生殖系统的表达情况,利用小鼠生殖道感染模型研究galectin-3在女性生殖道感染过程中的可能作用。方法:采用RT-PCR的方法初步鉴定小鼠生殖系统各组织中的galectin-3 mRNA的表达水平,通过阴道黏膜注射LPS不完全弗氏佐剂乳液建立小鼠的生殖道感染模型,免疫组化对ga-lectin-3蛋白在雌性小鼠生殖系统的表达进行定位分析。结果:在正常小鼠的子宫、阴道、输卵管及卵巢中都能够检测到galectin-3 mRNA的表达。Galectin-3蛋白主要表达在生殖道黏膜的上皮细胞表面和子宫腺。经LPS刺激后,galectin-3蛋白在阴道、子宫颈及子宫体的表达水平提高(P<0.05),尤其是刺激后24h子宫颈中galectin-3的表达量增加最多(P<0.01)。结论:LPS刺激能增加小鼠生殖道中galectin-3的表达,galectin-3在生殖道抗感染中可能发挥重要的作用。

不同人群血清中抗透明带抗体的检测

为了探讨抗透明带抗体的临床意义 ,本研究用纯化的猪卵透明带ZP3抗原制备抗卵透明带抗体酶联免疫检测试剂盒 ,采用ELISA方法检测不同人群血中抗透明带抗体 ,并用阳性血清与人卵巢组织切片进行免疫组化分析。结果显示不同年龄组妇女抗透明带抗体阳性率差异不显著 (P >0 0 5 ) ,不孕组阳性率 15 % ,与其他组相比有显著性差异 (P <0 0 5 )。ELISA检测到的透明带抗体阳性血清不与人卵巢组织切片中的透明带产生肉眼可见的沉淀反应。除了早孕组和老龄妇女 ,任何年龄阶段的女性均可出现抗透明带自身抗体 ,鉴于这些抗体不引起周期紊乱现象 ,却可能阻止受精 。

壳聚糖-卵透明带DNA纳米微囊的制备及其体外表达

目的:发展壳聚糖-卵透明带口服DNA粘膜免疫避孕疫苗.方法:首先利用基因工程技术构建含卵透明带特异抗原pZP3αDNA的真核质粒表达载体pVAX1-pZP3α,然后用壳聚糖C390包被pVAX1-pZP3α重组质粒制备免疫微囊,测定免疫微囊对质粒DNA的包裹率,用原子力显微镜(AFM)观察壳聚糖-DNA微囊的形态结构,并体外转染HeLa细胞,用间接免疫荧光法(IIF)检测pZP3α的瞬时表达.结果:pZP3αDNA正确插入到载体pVAX1中并与壳聚糖C390形成纳米免疫微囊,对重组质粒pVAX1-pZP3α的包裹率达90%以上.AFM成像技术显示这些微囊的直径为100nm到300nm不等,平均为224 6nm,形状为球形、椭圆形等.体外转染HeLa细胞用IIF法检测到了抗原pZP3α在细胞内的表达.结论:壳聚糖-卵透明带口服DNA纳米免疫微囊制备成功,为进一步发展更安全、方便、有效的卵透明带DNA避孕疫苗打下了基础.

原代和传代培养的人输卵管上皮细胞对小鼠胚胎体外发育的影响

为了检测人输卵管上皮细胞对早期胚胎体外发育的影响，将小鼠２细胞胚胎与人输卵管上皮细胞进行体外共培养．结果显示：无论原代培养还是传代培养的人输卵管上皮细胞都可使胚胎发育率提高，发育速度加快．经传代４次以后的细胞对胚胎发育的促进作用有下降的趋势，所以传代第１至第４代是应用于共培养的最佳选择．同一代细胞中已贴壁稳定生长的细胞对胚胎发育的促进作用比刚经传代尚未贴壁的细胞大．

一种快速筛选巴氏毕赤酵母高表达克隆的新方法

目的:为了准确、快捷地筛选到高表达的毕赤酵母工程菌株。方法:利用毕赤酵母的生理特点和免疫印迹的特异性,将转化子接种到MM板上至形成克隆,贴上NC膜,待NC膜被分泌产物湿润后,揭下NC膜,进行ELISA-dot鉴定,选出高表达克隆进行扩增、培养,并作SDS-PAGE和Westernblotting进一步确定。结果:该法的筛选结果与SDS-PAGE和Westernblotting相符。结论:与传统方法相比,该法具有高通量,快速,简便的优点,适合毕赤酵母工程菌株的筛选。

人巨细胞病毒重组基因表达质粒的构建

目的 用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 (Humancytomegalovirus ,HCMV)中抗原性较强的蛋白片段—gp5 2C末端和pp15 0C末端的DNA序列 ,插入pPIC9K质粒 ,构建适于酵母表达系统的重组表达质粒。方法 根据人巨细胞病毒糖蛋白gp5 2和磷酸蛋白pp15 0C末端的cDNA序列 ,设计出 2对引物。利用PCR的方法 ,以病毒培养液上清为模板 ,进行二轮PCR扩增 ,把两个目的基因串联在一起 ,将所得的DNA片段经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后用T4连接酶与pPIC9K质粒进行连接 ,然后导入大肠杆菌DH5α ,筛选出阳性转化子 ,并用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果 从人巨细胞病毒培养液上清中扩增出目的基因 ,PCR反应和双酶切鉴定结果与预期相符。

重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达

为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽 (rHCMVp) ,根据其基因序列 ,设计引物从pPIC9K rHCMVp上扩增得到目的基因片段 ,并导入毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33细胞中 ,筛选获得表达量较高的重组菌株 ,研究了该菌株生长的培养条件 ,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH值对人巨细胞病毒嵌合肽表达的影响。 2L发酵罐进行了高密度发酵 ,经 1 %的甲醇、pH6 0的条件下诱导48h ,最终菌体密度OD60. 0 达到 1 80 ,每升发酵液中含目的蛋白 78. 7mg ,产量比摇瓶提高了 4 8倍。rHCMVp可通过高密度发酵大量获得。

重组人卵透明带蛋白(rhZP3)的生物活性研究

为了研究毕赤酵母表达的重组人卵透明带蛋白(rhZP3)的生物活性,分别用空白培养液,含孕酮或rhZP3的培养液对人精子进行顶体诱发实验,用考马斯亮蓝染色法对顶体状态进行评价;用不同浓度的rhZP3以及空白培养液分别处理精子,然后再与卵子进行结合实验,观察经过不同处理的精子在精卵结合中的情况;用抗rhZP3抗血清与阴性血清分别处理卵子,再与精子进行结合实验,观察经过不同处理后的卵子在精卵结合中的情况。rhZP3诱发顶体反应实验结果显示,rhZP3处理组与空白对照组之间差异显著(P<0.01);精卵结合实验结果显示,各实验组和对照组之间存在显著性差异(P<0.01),rhZP3、抗rhZP3抗体均能抑制精卵结合。实验结果表明,rhZP3具有天然人卵透明带蛋白相似的活性。

人ZP3B-细胞表位嵌合肽DNA的设计和合成

目的 :设计和合成适合在昆虫细胞中表达的一个人ZP3B细胞表位的DNA序列。方法 :根据国外的研究基础 ,设计由人ZP3的B细胞表位肽段和外源Th细胞表位肽段串联而成的 4 5肽嵌合肽序列 ,并根据昆虫细胞对密码子的偏爱性设计出该嵌合肽的DNA序列。然后人工合成该嵌合肽的DNA链 ,并克隆到PUC18载体上。结果 :通过酶切分析和测序证明 ,合成的DNA与所设计的嵌合肽DNA序列一致。结论 : 按设计合成了人ZP3的B细胞表位和外源Th细胞表位串联而成的嵌合肽DNA序列。