基于3种抗原的融合表达蛋白建立牛分枝杆菌抗体ELISA检测方法

为建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法,以牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6蛋白为靶标抗原,通过酶切连接和重叠延伸PCR方法,将3个抗原基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接,构建出pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并分析其反应原性。以纯化后的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示:通过SDSPAGE和Western blot鉴定分析,成功表达并纯化出包涵体蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,目的蛋白具有良好的反应原性;以融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与其他牛病原体阳性血清不发生交叉反应。临床结果显示,本方法与商品化试剂盒阳性符合率为66.7%,阴性符合率99.3%,总符合率为99.3%。研究表明,成功串联表达了具有良好反应原性的融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,并以此为包被抗原建立了一种牛分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法,为检测和净化牛结核病提供了诊断工具。

鸟苷酸结合蛋白5在牛分枝杆菌诱导巨噬细胞极化过程中的作用

【背景】牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是重要的人畜共患病原体,严重危害公共卫生安全。巨噬细胞是牛分枝杆菌感染的主要效应细胞,M1型巨噬细胞极化对于宿主免疫防御M. bovis感染至关重要。【目的】探讨鸟苷酸结合蛋白5(guanylate-binding protein 5, GBP5)对M. bovis感染的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞M1、M2型极化的影响,以及GBP5在M. bovis感染中的作用。【方法】通过前期转录组学数据分析筛选出差异基因GBP5,通过体内、体外验证M. bovis感染后的GBP5的表达水平。小干扰RNA下调细胞内GBP5表达,分别利用RT-q PCR、Western blotting和流式细胞术检测M1、M2型巨噬细胞表面标志物表达变化;平板菌落计数法检测GBP5对M. bovis在巨噬细胞中复制的影响;双荧光素酶报告基因试验检测GBP5对信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)转录调控;Western blotting检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)抑制后STAT3的磷酸化情况。【结果】GBP5在M. bovis感染的RAW264.7细胞和C57BL/6小鼠组织中表达增加;下调GBP5后细胞内细菌CFU在感染后不同时间点均显著增加,ROS释放减少,M1型巨噬细胞表面标志物表达减少,但是对M2型巨噬细胞无显著影响;下调GBP5后抑制了STAT3的转录启动。ROS的产生抑制了STAT3的磷酸化。【结论】GBP5促进ROS的产生,调控ROS/STAT3通路,促进巨噬细胞向M1型极化,从而抑制细胞内牛分枝杆菌的存活。