根癌农杆菌介导的绿色木霉HP35-3转化及表达体系的构建

本研究通过根癌农杆菌介导转化法,构建丝状真菌绿色木霉HP35-3的遗传转化表达体系,并以红色荧光蛋白基因(DsRed2)为报告基因来验证本表达体系。首先构建含有潮霉素抗性基因(HygR)、磷酸甘油醛脱氢酶启动子(Pgpd)和红色荧光蛋白基因(DsRed2)的双元载体pCAMT-CPRFP。然后将该双元载体转化到根癌农杆菌EHA105中,并筛选阳性转化子。将该转化子和绿色木霉HP35-3分生孢子进行液体共培养,并在含有150μg/mL潮霉素抗性平板上筛选出绿色木霉HP35-3RFP阳性转化子。最后分别通过如下三种方法检测:提取HP35-3RFP的总DNA进行PCR验证;对菌丝体进行荧光显微镜观察;对菌丝体提取物进行荧光酶标仪检测。结果表明:获得的转化子能够稳定遗传,外源红色荧光蛋白基因整合到木霉HP35-3的基因组中并成功表达。