NaCl处理谷子萌发期种子的转录组学分析

【目的】谷子具有抗旱、耐贫瘠的特性,逐渐成为研究禾本科作物的模式作物。本研究以前期筛选并获得的谷子耐盐品种和敏感品种为材料,通过RNA-Seq测序筛选鉴定谷子的盐胁迫响应基因,揭示其响应盐害机制,为培育谷子抗盐新种质提供理论依据。【方法】对14个谷子品种进行了萌发期抗盐筛选。谷子不同品种的种子经150 mmol·L-1NaCl处理萌发培养7 d后,分别统计各品种种子的萌发率、根长和芽长,综合各项指标鉴定到豫谷2为耐盐品种、安04为盐敏感品种。以这两个品种盐胁迫前、后萌发期种子为材料,应用RNA-Seq进行转录组测定,分析鉴定盐害下差异表达基因(differentially expression gene,DEG),并对DEG进行GO和KEGG功能富集分析。同时应用qRT-PCR对随机挑选的15个DEG表达模式进行验证,并与RNA-Seq结果进行相关性分析。【结果】耐盐品种豫谷2、盐敏感品种安04种子经盐胁迫处理后,分别鉴定出2786个和4413个DEG;其中,每个品种在NaCl处理前及处理后分别鉴定出1470和3826个DEG。GO和KEGG聚类分析显示,NaCl处理下参与信号转导、抗氧化、有机酸的合成及转运以及次生代谢等相关的DEG在谷子萌发期种子应对盐胁迫响应过程中具有关键性的作用,DEG主要集中在胁迫响应、离子的跨膜转运、氧化还原、次生代谢及有机酸、多胺、苯丙烷的合成等过程。qRT-PCR对15个DEG表达模式的检测结果与RNA-seq结果相关系数为0.8817。其中编码离子通道的基因(HKT)、过氧化物酶基因(POD)、黄烷酮-3-羟化酶基因(FL3H)、MYB转录因子基因等在豫谷2中表达量较高,显示其在谷子萌发期种子响应盐胁迫中可能发挥一定作用。【结论】谷子耐盐品种及盐敏感品种的种子对盐胁迫的响应程度具有一定的差异性,且品种对盐害的耐受能力主要与基因对胁迫的响应程度相关,而与DEG的数量相关性不大。

光敏色素互作因子(PIFs)对植物生长发育的调控

光敏色素相互作用因子(PIFs)属于拟南芥bHLH转录因子家族的第15亚族,是光信号响应过程中的关键负调控因子。光激活的光敏色素通过促进PIFs蛋白降解,直接或间接抑制它们与DNA的结合,从而实现光对植物生长发育的调控。研究发现PIFs在调控种子萌发、幼苗形态建成、避荫反应、昼夜节律以及各种植物激素响应过程中起着重要作用。此外,PIFs作为细胞信号传导的"枢纽"具有更为广泛的作用,能够整合不同信号,精细调控整个转录网络。

四翅滨藜的抗逆性及其应用研究进展

四翅滨藜[Atriplex canescens(Pursh)Nutt.]又称灰毛滨藜,具有速生、耐干旱、耐贫瘠、抗盐碱等优良特性,是荒漠化和盐碱地改良的优良木本饲料植物。本文就四翅滨藜的形态学特征、表型变异、土壤改良和水土保持作用、牧草价值、抗逆基因挖掘和功能解析,以及盐碱、干旱、低温胁迫抗性等方面进行综述,旨在为利用该物种进行荒漠、滩涂、盐碱地治理和饲料生产提供科学依据。

植物MAPK信号转导组分的细胞定位与选择性剪接

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径在真核生物中是高度保守的,由MAPKs,MAPKKs,MAPKKKs组成,通过MAPKKK→MAPKK→MAPK逐级磷酸化传递细胞信号.已有大量研究表明,MAPK在植物响应生物与非生物胁迫,以及植物激素和细胞周期的信号转导中起重要作用.在植物响应各种逆境过程中激活的MAPK基因,细胞内的定位发生动态变化.选择性剪接是真核生物中调节基因表达的重要模式,能够影响蛋白的结合特性、胞内定位、酶的活性、蛋白的稳定性和翻译后的修饰.MAPK基因的选择性剪接能产生不同的转录异型并具有不同的亚细胞定位.本文综述这方面的研究进展.

荧光素酶互补法对谷子中SiPKS32/SiCaBP5的互作研究

盐害极大影响了作物的产量和品质。SOS信号途径作为植物耐盐性的重要信号通路,主要包括三类基因,即SOS1、SOS2和SOS3,其中SOS2和SOS3复合物的形成,对于激活SOS1从而行使SOS信号通路维持离子稳态及参与植物抗盐胁迫的功能具有重要作用。谷子作为抗逆耐贫瘠作物,解析其是否存在SOS信号途径及其在盐胁迫下的响应模式具有重要意义。本研究参考已知SOS2、SOS3基因序列,在谷子中同源克隆SOS2基因SiPKS32、SOS3基因SiCaBP5,并进一步构建了SiPKS32、SiCaBP5基因与荧光素酶片段cLUC、nLUC的融合表达载体,利用烟草瞬时荧光素酶互补系统分析基因互作情况。结果显示,SiPKS32与SiCaBP5共侵染烟草可产生荧光,基因间存在互作。该结果为探索谷子中是否存在SOS信号通路及其调控网络,进而为利用基因工程手段培育抗逆作物新品种奠定基础。

谷子SiRLK35基因克隆及功能分析

为探讨谷子(Setaria italica L.)耐旱抗逆机制,解析类受体蛋白激酶(receptor like protein kinase,RLKs)基因功能,进而为培育谷子抗逆新品种提供依据,本文以干旱处理的谷子"豫谷1号"为材料,通过i TRAQ技术筛选到1个干旱响应的类受体蛋白激酶基因,命名为SiRLK35。以谷子RNA反转录的单链cDNA为模板,经PCR扩增获取SiRLK35基因全长序列。应用qRT-PCR方法,对SiRLK35在NaCl、PEG、ABA、GA、Me JA等不同处理下的表达模式进行分析。进一步构建基因原核表达载体pET28a-SiRLK35,结合斑点法对SiRLK35的抗盐能力进行初步评价。同时构建过表达载体p CAMBIA1301P-SiRLK35转化水稻,并对转基因植株抗盐能力进行检测。结果显示:胁迫及激素处理均可不同程度诱导SiRLK35基因的表达;斑点法研究结果显示,在相同NaCl浓度的LB平板上,含有SiRLK35基因的原核表达载体的大肠杆菌菌株生长状态较阴性对照好,SiRLK35具有一定的抗盐能力;获得的转SiRLK35基因水稻植株对盐胁迫的耐受性高于对照。SiRLK35基因对不同胁迫均可以产生响应,但对盐胁迫的响应较为明显,推测该基因可能在谷子的抗盐及抗逆过程中发挥作用。

水稻蛋白激酶基因启动子OsSRLp的分离及特性分析

【目的】为研究水稻中I型酪蛋白激酶基因Os SRL启动子的结构及功能,【方法】以水稻中花11基因组DNA为模板,经PCR扩增获得基因上游约1600 bp序列,命名为启动子Os SRLp。应用PLACE在线软件,分析序列中的顺式作用元件,同时构建含有GUS报告基因的植物表达载体,转化水稻。【结果】Os SRL为组成型表达,Os SRLp含有调控生殖发育、激素应答及逆境响应等多种顺式作用元件。Os SRLp驱动的GUS报告基因在根、茎中均有所表达,在小穗中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度较低。【结论】Os SRLp为组成型启动子,其下游调控基因Os SRL可能参与水稻发育及生殖过程。

谷子遗传转化体系研究进展

谷子(Setaria italica)是原产于我国的特色杂粮作物,具有抗旱、耐瘠、耐盐碱、营养丰富等特点,但其生物技术研究相对滞后。本文综述了近年来谷子组织培养、再生体系、遗传转化方法的研究进展,着重介绍了利用农杆菌介导转化及再生体系,并对可能影响转化过程及效果的相关因素进行了阐述。

谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35的克隆及原核表达

本研究以"豫谷1号"c DNA为模板,通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因SiRLK35(NCBI登录号:XM_004956247.2)的全长序列。生物信息学分析显示,该基因编码蛋白由392个氨基酸残基构成,包含一个S_TKc保守结构域以及一个TFS2N结构域,含3个跨膜结构域,N端有信号肽。SiRLK35基因经Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后,利用p ET-28a构建原核表达载体,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经0.5 mmol/L IPTG于25℃诱导12 h后,在44.6 k D处得到一明显诱导表达蛋白条带,表达产物与预期相符,证明SiRLK35基因可在大肠杆菌中诱导表达。该结果为进一步研究SiRLK35基因功能奠定基础。

谷子胁迫诱导型启动子SiRLK35P的分离及生物信息学分析

本研究以谷子"豫谷1号"为材料,结合相关数据库检索,以谷子幼苗提取的基因组DNA为模板,经PCR特异扩增SiRLK35上游1 893 bp调控序列,命名为SiRLK35P。结合PLACE数据库,对SiRLK35P进行生物信息学分析,并对其诱导表达情况进行了预测。结果显示,SiRLK35P中含有ABRELATERD1(ACGT)、GCCCORE(GCCGCC)等多种顺式作用元件,部分元件已知与不同逆境胁迫及应答相关,预测该启动子可能参与谷子胁迫响应,调控下游基因在胁迫等逆境条件下的表达水平,从而对谷子在胁迫下的应答进行调控。该研究为定向改良谷子抗逆特性、培育谷子抗逆新品种提供了候选材料。

干旱胁迫下谷子的转录组分析

谷子作为我国的传统优势作物,具有抗旱、耐瘠薄、基因组小等突出优势,已逐渐发展为研究禾本科作物新的模式作物。利用高通量RNA-seq技术,我们对干旱胁迫6 h和6 d的谷子进行转录组测定,筛选表达差异基因。结果显示,干旱胁迫后的差异基因主要富集在生物学通路及代谢通路中,其中编码蛋白激酶、磷酸酶、信号转导组分、转录因子、功能蛋白等基因的表达变化较明显。尤其在干旱胁迫6 d后,谷子中E3泛素连接酶介导的泛素蛋白酶体途径被明显激活。该研究对于筛选谷子抗旱基因进而揭示谷子的抗旱机制提供了重要依据。

水稻突变体库的构建及部分性状分析

利用不同技术创制突变体是作物遗传改良和功能基因组学研究的重要途径。本研究利用强磁场对水稻品种圣稻15进行辐射诱变,在构建水稻突变体库的基础上,经多年种植及筛选,获得93份在性状上与对照有明显差异的突变体。其差异表型主要集中在叶色、叶片形态、株高、抽穗期、穗型、粒型等方面。这些材料作为新的种质资源,将有助于水稻功能基因组学的研究及遗传育种。

水稻细胞色素P450基因OsDWARF48调控株高的功能分析

本研究以水稻中花11为材料克隆了一个P450家族基因,命名为OsDWARF48。该基因在水稻中为组成型表达,在幼胚中的表达量最高;并且其表达受到BR的抑制。进一步以获得的基因过表达及反义转基因植株为材料,对株高进行测量,结果显示,OsDWARF48反义转基因株系株高明显矮于对照,而过表达转基因株系OE3株高明显高于对照。通过对水稻内源生长素、油菜素内酯和赤霉素的含量测定,发现3种激素在反义转基因株系中含量均下降,在过表达转基因株系OE3中含量均上升,表明OsDWARF48通过调控BR合成及信号转导途径,进而与GA和IAA协同作用调控水稻株高。

应用定量蛋白质组学对谷子干旱响应蛋白的研究

谷子是我国的传统优势作物,具有抗旱、耐瘠薄、高光效以及基因组小、生育期短等突出优势,受到国际遗传学界的高度重视,已迅速发展成为功能基因组研究新的候选模式作物。但目前在蛋白质水平上解析谷子干旱响应的研究还较少。本研究利用TMT(tandem mass tags)体外同重同位素标记的相对与绝对定量技术,筛选并鉴定谷子干旱响应蛋白。研究发现谷子干旱响应差异蛋白主要参与胁迫响应、碳代谢、光合作用和蛋白合成等相关代谢途径。该研究对于深入解析谷子的抗旱机制,培育抗旱耐逆谷子新品种具有重要意义。

水稻羧酸酯酶基因OsCDAP的克隆及表达分析

羧酸酯酶是一大类水解酶家族,催化短链脂肪酸酯键水解,在植物中参与除草剂代谢、信号分子激活、植物胁迫响应等过程。前期通过感染黑条矮缩病水稻数字表达谱鉴定到一个在病毒侵染后表达明显上调的羧酸酯酶基因。本研究以水稻中花11为材料克隆了该基因,将其命名为OsCDAP。生物信息学分析显示,该基因属于羧酸酯酶家族,与烟草中羧酸酯酶Nthsr203J的相似性最高,可达95%。组织表达模式分析显示,该基因在水稻茎中表达量最高,且为赤霉素诱导表达,并受赤霉素合成抑制剂PAC的抑制。该研究为进一步解析羧酸酯酶基因功能奠定了基础。

水稻羧酸酯酶OsCDAP的生物学功能初探

本课题组在对水稻病害的研究中,鉴定并克隆到一个羧酸酯酶基因OsCDAP。为进一步研究该酯酶生物学功能,构建了OsCDAP植物过表达载体,通过农杆菌介导的方法转化水稻"中花11"。转基因水稻表型分析显示,过表达转基因水稻植株株高略高于对照,其第一节间长度明显长于对照,而第五节间长度明显短于对照,其他节间长度差异不明显;OsCDAP过表达株系的剑叶夹角明显大于对照。进一步对转基因水稻GA和BR合成及信号转导相关基因进行分析,发现部分基因的表达发生改变。本试验结果显示OsCDAP可通过调控内源GA和BR的含量及参与相关信号途径调控水稻节间长度及叶夹角大小,进而对水稻的生长发育产生影响。

谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35在水稻中对盐胁迫的响应

【目的】盐胁迫影响作物的产量和品质,而作物的耐盐性受特定基因的调控。在前期获得谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35过表达水稻株系的基础上,拟结合植株在盐胁迫下的表型,对部分盐胁迫指标及响应基因的表达模式进行检测和验证,解析谷子SiRLK35参与盐害响应的可能机制。【方法】选取谷子SiRLK35过表达水稻株系,分别为过表达株系(over-expression,OE)-1(OE-1)、OE-2和OE-3,以野生型中花11为对照,实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测各株系中SiRLK35的表达情况;分别用含0、150和200 mmol·L-1 NaCl的MS培养液处理三叶期的对照及转基因株系幼苗,观察其表型,统计150 mmol·L-1 NaCl处理3 d后苗长及根长;用150 mmol·L-1 NaCl处理四叶期幼苗,统计处理14 d后材料干重、死亡率和死叶率,对各材料的耐盐性进行评价;进一步挑选SiRLK35过表达程度高且耐盐表型好的OE-1株系,利用3,3'-二氨基联苯胺(3,3'-Diaminobenzidine,DAB)和氮蓝四唑(nitrotetrazolium blue chloride,NBT)染色检测其胁迫下过氧化物积累及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化物酶(peroxidase,POD)的活性;并对部分盐害响应基因的表达模式进行检测。【结果】谷子SiRLK35在株系OE-1中的相对表达量最高;150 mmol·L-1NaCl处理3 d幼苗后,中花11苗长和根长的生长受抑制程度均大于SiRLK35过表达株系,其中OE-1的受抑制程度最小;四叶期幼苗经150 mmol·L-1 NaCl处理14 d后,转基因株系地上部和地下部干重降低幅度均低于对照,且幼苗死亡率和死叶率均低于对照;盐胁迫下对照过氧化染色反应明显,O2-和H2O2的积累均高于过表达植株,SOD和POD抗氧化酶活性均高于对照;部分盐害响应基因在SiRLK35过表达株系中表现为上调,其中,OsLEA3在盐处理24 h的相对表达量是对照中的1.9倍。【结论】谷子SiRLK35异源转化水稻获得的过表达株系对盐胁迫具有一定的抗性,SiRLK35可通过调控抗氧化酶活性及相关信号途径,从而参与盐害响应。

水稻类受体蛋白激酶OsESG1的原核表达

水稻类受体蛋白激酶Os ESG1在种胚中特异表达,属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Os ESG1基因全长c DNA经XhoⅠ、Bam HⅠ双酶切,与同样经双酶切的原核表达载体p ET-28a(+)经T4 DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21。原核表达结果显示,Os ESG1可受1 mmol/L IPTG诱导表达,且蛋白表达量随诱导时间的延长而逐渐增加,诱导7 h后,蛋白表达至较高水平。对不同浓度IPTG诱导下的蛋白表达情况进行研究,结果显示,0.1 mmol/L IPTG对Os ESG1的诱导表达效果最好。

AhSOS2转基因水稻基因表达及抗逆性分析

SOS2(salt overly sensitive 2)作为植物中一类重要的耐盐相关基因,在调控细胞内离子平衡、参与植物对盐害的响应及适应过程中具有重要作用。前期已从花生叶片中分离到基因AhSOS2(Gen Bank登录号为HG797656),其属于SOS2类基因,编码446个氨基酸,为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本研究以该基因的转基因水稻株系SOS2-1、SOS2-2、SOS2-3、SOS2-7为材料进行荧光定量PCR,分析基因转录表达情况。结果发现,AhSOS2基因在四个转基因株系中均有表达,且在株系SOS2-3中的表达量高于其它株系。对转基因水稻株系进行250 mmol/L Na Cl处理后,检测其相对电导率和脯氨酸、MDA含量,以及抗氧化酶SOD、POD、CAT、APX酶活等胁迫相关的生理指标。结果显示,胁迫条件下,转基因水稻株系相对电导率低于对照,参与胁迫响应的酶活高于对照,说明AhSOS2对提高受体材料的抗盐及抗胁迫能力具有一定作用。该结果为进一步研究AhSOS2及SOS2基因家族功能、解析其对盐害等逆境的适应机制奠定基础。

盐胁迫下谷子根部细胞内pH值测定

利用BCECF-AM荧光染料和激光共聚焦显微镜测定谷子根部细胞内的荧光强度,进而换算成细胞内pH值,以此来研建测定谷子根部细胞内pH值的方法。结果显示:正常水培条件下,谷子品种YG2和AN04根部细胞内pH值分别为5.85±0.11和5.77±0.26;盐处理下YG2和AN04根部细胞内pH值分别达到6.21±0.26和6.19±0.17,即盐敏感品种AN04根部细胞盐处理后pH值变化较大,提高7.28%,而抗盐品种YG2提高6.15%。这说明抗盐品种盐胁迫下细胞内pH值受外界环境影响较小,对盐害的耐受力较高。该方法用来定量测定细胞内pH值具有可信性,亦可作为评价植物耐受胁迫能力的辅助手段。