桂糖42号胚性愈伤组织高效诱导及相关内源激素的动态变化

以优良甘蔗品种桂糖42号心叶为外植体,以MS为基本培养基,探究不同浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)及营养成分[水解酪蛋白(CH)和椰汁(CW)]对甘蔗胚性愈伤组织诱导效果的影响,优化甘蔗胚性愈伤组织诱导培养基;测定诱导胚性愈伤组织发生过程中不同组织样品的4种激素[玉米素核苷(ZR)、赤霉素(GA3)、生长素(IAA)和脱落酸(ABA)]含量。结果表明,甘蔗心叶在添加3.0 mg/L 2,4-D的MS培养基中其愈伤组织诱导率达93.33%,第一代愈伤组织转接于添加3.0 mg/L 2,4-D和100.0 mL/LCW的MS培养基,其胚性愈伤组织诱导率达83.33%;在甘蔗胚性愈伤组织诱导过程中,内源激素ZR和GA3含量呈下降趋势,IAA和ABA含量呈上升趋势,胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织间的4种激素含量均存在显著差异(P<0.05),其中,胚性愈伤组织的GA3含量是非胚性愈伤组织的1.77倍。本研究将甘蔗愈伤组织诱导培养基优化为MS+3.0 mg/L 2,4-D,继代培养基优化为MS+3.0 mg/L 2,4-D+100.0 mL/LCW,并初步揭示甘蔗胚性愈伤组织诱导过程中内源激素含量的变化规律,可作为甘蔗优质胚性愈伤组织培养的参考依据。

甘蔗节间蔗糖含量与和蔗糖代谢相关的4种酶活性之间的关系剖析

测定和分析2个品种甘蔗节间蔗糖含量与和蔗糖代谢相关的4种酶活性之间关系的结果表明:节间蔗糖含量与酸性转化酶活性成极显著负相关,与蔗糖磷酸合成酶活性呈显著正相关。从通径分析结果可知,4种关键酶中可溶性酸性转化酶和蔗糖磷酸合成酶是对蔗糖含量贡献程度最大的2个酶.

甘蔗节间Mg^(2+)-ATP酶活性与节间生长的关系

对8个甘蔗基因型即粤糖86-368、新台糖16号、农林8号,拔地拉、割手密以及从甘蔗杂交后代F1的实生苗中选出的3株种茎的无性系,在伸长初期测定+2至+8节间长度、茎径,+3、+5、+8节间可溶性Mg2+-ATP酶、细胞壁离子型Mg2+-ATP酶、细胞壁共价型Mg2+-ATP酶活性及可溶性总糖含量.结果表明,从+2到+8节间,不同基因型节间长度的变化极为相似.除割手密外,其它基因型的节间长度都在+6节间达到最长;但茎径在+6节间之后仍保持稍微的增粗.从+3到+5、+8节间,不同基因型的3种Mg2+-ATP酶活性都逐渐下降,而可溶性总糖含量逐渐提高.其中,节间较粗的3个基因型3种Mg2+-ATP酶的活性和可溶性总糖含量都相对较低.

甘蔗节间蛋白质含量与生长发育关系的研究

选用8个不同基因型的甘蔗,即粤糖86-368、新台糖16号、农林8号、拔地拉、割手密和从甘蔗杂交后代F1中选出的3株种茎的无性系(单株)。在甘蔗伸长初期,测定其+2节间至+8节间的长度、茎径,同时取+3、+5、+8节间,测定其可溶性蛋白质、细胞壁离子型结合蛋白质、细胞壁共价型结合蛋白质及可溶性总糖的含量。结果表明:从+2节间到+8节间,不同基因型的节间长度的变化极为相似,除割手密外,其它基因型甘蔗的节间长度都在+6节达到最长;但其茎径在+6节间以后仍保持稍微的增粗。从+3节间到+5、+8节间,所有基因型的三类蛋白质含量都逐渐下降,而可溶性总糖含量都逐渐提高。其中,三个节间较粗的基因型即拔地拉、粤糖86-368和无性系3号,其三类蛋白质含量相对较高,而可溶性总糖含量相对较低。

较高浓度乙烯利对甘蔗叶片生长和若干生理生化特性的影响

在甘蔗分蘖期用200mg/L乙烯利对桂糖15号和新台糖1号进行叶面喷施,在处理后不同时期取样测定叶片的叶长、叶宽及若干生理生化指标,以探讨乙烯利对甘蔗叶片生长及生理生化的影响。结果表明:在乙烯利处理后的一定时间内,叶片的生长先受抑制随后逐渐恢复到对照水平;叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、淀粉酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶等酶活性表现出先下降后提高,而中性转化酶的活性则先提高后下降。

甘蔗蔗糖磷酸合成酶SPSⅢ基因表达的初步研究

【目的】了解蔗糖磷酸合成酶基因在甘蔗中表达特性及其对甘蔗糖分积累影响的作用机理。【方法】以甘蔗品种桂糖28号(GT28)、拔地拉、新台糖20号(ROC20)、新台糖22号(ROC22)为供试材料,选取0叶、+1叶、幼嫩叶鞘、幼茎,通过半定量RT-PCR法对甘蔗SPSIII基因的表达进行分析。【结果】SPSIII在4个甘蔗基因型中的0叶、+1叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,在GT284个不同部位的表达量较低,在拔地拉4个不同部位表达较均匀,在ROC204个部位中以嫩叶鞘的表达较高,在ROC22中以幼茎的表达较高。【结论】SPSIII在4个甘蔗基因型中的0叶和+1叶、幼嫩叶鞘和幼茎中均有表达,但SPSIII表达因甘蔗基因型不同而有所差异。

甘蔗抗虫转基因研究进展

甘蔗是世界最重要的糖料作物,但日益严重的虫害给甘蔗产量及品质造成了重大损失。目前甘蔗抗虫转基因育种已成为甘蔗抗虫育种最有效的途径之一。近年来,美国、澳大利亚、巴西、南非、古巴、泰国、印度、新加坡、中国及一些国际大型公司等都相继开展了甘蔗抗虫转基因研究,主要集中于转Bt基因、GNA基因、PI基因等甘蔗材料的筛选,并获得一批抗蔗茎螟的CryⅠA(b)转化植株、抗Chilo infuscatellus的转Cry1Ab基因甘蔗植株、抗绵蚜的转GNA基因甘蔗植株、抗甘蔗白螟的转PⅠ基因甘蔗植株、抑制蛴螬幼虫生长的转PiⅡ和GNA基因甘蔗无性系G87、UP87及600多份转cry1C*基因甘蔗无性系,部分学者还对转Bt基因甘蔗植株的生理、抗虫性和农艺性状进行了研究。由于抗虫转基因甘蔗研究起步晚,受抗虫基因来源及知识产权保护等方面的限制,其研究进展缓慢,目前尚未培育出优良的甘蔗抗虫品种并推广种植。今后需对外源基因在转基因甘蔗无性后代中的整合、遗传表达特性及甲基化修饰等影响表达的各种因素进行综合研究,提高外源基因在甘蔗无性繁殖中遗传和表达的稳定性;此外,还需对抗虫转基因甘蔗的抗虫机理进行系统、深入的研究,为筛选出优良的、稳定遗传的抗虫甘蔗品种并在生产中推广应用提供理论依据和育种材料。

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

【目的】利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株。【方法】以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验。利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组。【结果】愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30mg/L。获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株。MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%。【结论】建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率。

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

【目的】构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础。【方法】在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析。【结果】文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500～2000bp,平均长度约1102.1bp。挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig29个,singlets439个,分别占总数的6.5%和93.5%。通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%。【结论】构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因。

不同甘蔗品种的含糖特性及成熟期分析

为进一步了解甘蔗不同品种成熟过程中糖分积累变化过程和工艺成熟过程的特点,以6个不同甘蔗品种为材料,在工艺成熟期对蔗茎蔗糖分、蔗汁还原糖分、蔗汁重力纯度和节间的蔗糖、还原糖含量进行分析。结果表明,ROC 20属特早熟特高糖品种,ROC 16、ROC 22为早熟高糖品种,GT 18属早中熟高糖品种,GT 17为中熟高糖品种,RB 72-454属含糖一般的早中熟品种。

利用虚应变分析沥青混合料的粘弹性质

沥青混合料是典型的粘弹性材料之一,其行为特性较为复杂,利用虚应变则可以简化沥青混合料的粘弹性分析过程。对Superpave13沥青混合料进行了不同条件下的复数模量试验,并将试验结果转化为沥青混合料松弛模量的Prony系列表达式;分别进行了半正弦荷载试验和恒应变压缩试验,利用松弛模量计算了虚应变,并对采用虚应变的沥青混合料粘弹性本构关系进行研究。结果表明,利用虚应变可以消除粘弹性材料的应力-应变滞后效应和对荷载作用速度或时间的依赖性,而且应力-虚应变呈线性关系,从而可以利用广义弹性-粘弹性对应原理对混合料的行为特性进行分析,达到简化粘弹性分析的目的。

甘蔗Δ~1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(ScP5CS)基因分离及其分析(英文)

以甘蔗品种ROC22为材料,待甘蔗生长至4～5叶期直接以25%PEG6000淋灌根部模拟水分胁迫。采用同源克隆与RT-PCR法从甘蔗叶片中得到甘蔗Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Saccharum officinarum L.Δ1-pyrroline-5-carboxy-late synthetase,ScP5CS)基因的编码区cDNA序列,其长度为2151 bp,为一个完整的ORF,编码716个氨基酸,GenBank注册号为EU005373。核苷酸序列与前人已注册的甘蔗P5CS(EF155655)相比,同源率达到98%,但推断编码的氨基酸同源率仅为92%。该基因具有P5CS共有的结构域与结合位点:Putative ATP-binding site;Putative leucine domains;Glu-5-kinase domain;Putative NADPH-binding domain;Conserved GSA-DH domain保守区,脯氨酸反馈抑制作用位点。与前人已注册的甘蔗P5CS基因氨基酸序列(ABM30223)比较,在γ-GK保守域(Glu-5-kinase domain)内氨基酸变化较大,而与水稻、小麦的相比,其变化较小。因此,推断为甘蔗P5CS基因家族中的一个新成员。

杀虫基因高效植物表达载体的构建

以质粒pCAMBIA1200、pBI121、pMMAR和pC1300MAR为基础,通过酶切连接,构建植物中间载体pC2MARHyg;再利用pAVAc质粒、载体pGA1611和中间载体pC2MARHyg,构建含有Ubi-1启动子、顺向重复MAR和杀虫基因AVAc的高效植物表达载体pC2MAR-AVAc,然后转化农杆菌EHA105,经筛选鉴定获得阳性克隆,为进一步开展植物抗虫基因工程研究奠定基础。

黑皮果蔗(Badila)节间蔗糖质量分数及其关键酶活性和相关基因表达的分析

以成熟期黑皮果蔗(Badila)的第2、5、8、12节间为材料,分析测定其节间蔗糖质量分数与相关关键酶如蔗糖磷酸合成酶(sucrose-phosphate synthase,SPS)、可溶性酸性转化酶(soluble acid invertase,SAI)、中性转化酶(neutral invertase,NI)活性,并采用RT-PCR对SPS、SAI基因在4个不同节间部位中的表达差异进行半定量分析。结果表明,成熟期黑皮果蔗蔗茎中不同节间的蔗糖、还原糖质量分数均随着节间的成熟而增加,成熟节间>未成熟节间;蛋白质质量分数则相反,为未成熟节间高于成熟节间。SPS活性与SPSⅢ基因表达则是在幼嫩茎的活性高于成熟茎;SAI活性也是幼嫩茎大于成熟茎,其基因表达差异表现不明显。NI活性以第5节间最低,其他3个节间无极显著差异。

可溶性酸性转化酶SAI基因在不同甘蔗基因型中表达分析

探讨与蔗糖代谢相关的甘蔗可溶性酸性转化酶(soluble acid invertase,SAI)基因时空表达,比较了桂糖28号(GT28)、拔地拉、新台糖20号(ROC20)、新台糖22号(ROC22)四个甘蔗基因型的+1、0叶、幼嫩叶鞘和幼茎4个部位在工艺成熟期中甘蔗SAI基因的表达水平。结果表明,在工艺成熟期甘蔗SAI在4个甘蔗基因型中4个部位均检测到其有表达,但甘蔗SAI表达水平在不同甘蔗基因型与组织部位因在不同工艺成熟阶段而有所差异。其中,SAI基因在工艺成熟前期有较高表达,而后逐渐下低,但在不同基因型的不同部位中表达规律性不是很明显,这可能与所用的甘蔗材料遗传背景等有关。

甘蔗乙烯受体基因Sc-ERS的克隆与序列分析

根据已知乙烯受体基因的序列信息,设计1对简并引物和1对特异引物,对甘蔗叶片基因组DNA进行PCR扩增,获得1个甘蔗乙烯受体基因(Sc-ERS)的片段,其大小为4310 bp,包含1个由5个外显子和4个内含子组成的4219 bp大小的完整编码区。Sc-ERS编码区与玉米乙烯受体ERS1基因(AY359578)、水稻乙烯受体ERS1基因(AY043031)编码区的同源性分别为91.4%、61.6%;推导Sc-ERS编码的蛋白包含636个氨基酸残基,与玉米、水稻乙烯受体基因所编码蛋白的氨基酸同源性分别为94.1%、89.4%。其推导蛋白结构分析结果显示,Sc-ERS编码的蛋白和玉米、水稻ERS1所编码的蛋白相同,在N段保守区含有3个跨膜结构,并由3个跨膜结构、GAF结构、HisKA和HATPase_c组成功能域。核苷酸序列分析和蛋白质结构分析结果表明,Sc-ERS基因属于ERS1基因。

木豆凝集素提纯

木豆凝集素粗样先经伴刀豆凝集素—琼脂糖凝胶(Con A-Sepharose 4B)亲和层析吸附可去除部分杂质,但凝集素本身并未被亲和吸附,而是随缓冲液排出,再经交联葡聚糖(Sephadex G-100)凝胶过滤层析,得到纯化的木豆凝集素,得率为7.8%,凝血效价提高1280倍。

生物技术开放实验室管理经验探讨

广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室是广西农业生物技术研究的重要基地,实验室长期坚持高度开放的管理模式,通过建立规范的管理制度、做好仪器使用技术及安全知识培训、合理的仪器配置与规范化管理、与有关单位共建科研基地、加强人才管理队伍建设及鼓励和促进科技人员充分利用实验室的研究平台开展高水平的研究工作等方面的管理措施,经过几年的发展与完善,基本形成了一个长效制度,使开放实验室实现安全、高效运行,并取得了良性发展。

DNA分子进化研究进展

分子进化和重组技术在蛋白质体外进化工程中占据着越来越重要的地位,它可以对单一基因、质粒、代谢途径、部分甚至整个基因组进行改造,从而在较短时间内获得漫长自然进化过程无法得到的具有特定性质的基因、蛋白质甚至物种。文章通过综合概括各种DNA分子进化技术的原理、特点,并介绍这些技术的应用研究进展以及最新研究方向,促进其在提高酶活性、蛋白质产量和改善蛋白质(酶)的性能等方面广泛应用。

大旗瓣凤仙花与瑶山凤仙花叶绿体全基因组比较及系统发育分析

【目的】比较大旗瓣凤仙花和瑶山凤仙花的叶绿体全基因组序列,并分析凤仙花属20个物种的系统发育情况及遗传进化关系,为证实这两个分类群的早期植物学分类及其种质资源利用和遗传改良提供理论依据。【方法】基于BGISEQ-500测序平台,对大旗瓣凤仙花和瑶山凤仙花叶绿体基因组进行测序,利用Fastp软件和NOVOPlasty v.2.6.2程序对叶绿体基因组进行组装。利用CpGAVAS在线工具对叶绿体基因组序列进行注释,并使用MAFFT v.7.0、CAIcal、REPuter、MISA和FastTree等生物信息学软件进行序列比对、密码子偏性分析、重复序列定位及简单重复序列(SSRs)和系统发育分析。【结果】大旗瓣凤仙花和瑶山凤仙花叶绿体基因组长度分别为152437和152286 bp,GC含量分别为36.77%和36.80%;其中大单拷贝(LSC)区分别为83331和83212 bp,小单拷贝(SSC)区分别为17376和17312 bp,反向重复区(IRa和IRb)分别为25865和25881 bp。大旗瓣凤仙花和瑶山凤仙花叶绿体基因组均包含88个蛋白编码基因、8个rRNA基因和37个t RNA基因,且无假基因。系统发育分析结果表明,凤仙花属内的物种分类与基于系统形态学分析的早期植物学分类一致;虽然大旗瓣凤仙花和瑶山凤仙花叶绿体基因组非常接近,但二者为不同的凤仙花属种类,而不是早期形态分类学上的两个亚种水平。【结论】大旗瓣凤仙花和瑶山凤仙花为2个独立的凤仙花属种类,二者叶绿体基因组发生部分遗传变异,鉴定出的SSRs位点可用于物种鉴定和群体遗传学研究。