MSI2对DHT诱导的KGN细胞增殖凋亡失衡的影响

目的探究Musashi-2(MSI2)过表达对二氢睾酮(DHT)诱导的人卵巢颗粒细胞系(KGN)细胞增殖和凋亡失衡的影响。方法对人卵巢颗粒细胞(GCs)原代培养进程中的基因表达谱进行统计分析,筛选其中的差异表达基因。构建pc DNA3.1-MSI2真核表达质粒,瞬时转染至KGN细胞中,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot技术检测MSI2的过表达效果。在DHT诱导的KGN细胞中过表达MSI2后,然后分别利用四唑盐(MTT)比色法和5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)染色法检测各组细胞的增殖情况,并进一步利用流式细胞术(FCM)检测各组细胞的凋亡情况。结果MSI2的mRNA表达水平在人卵巢GCs原代培养过程中逐渐下降。成功构建pc DNA3.1-MSI2真核表达质粒,转染至KGN细胞中能够提高MSI2的mRNA和蛋白表达水平。MTT、Ed U和FCM结果显示与空白组相比,DHT诱导能够明显降低KGN细胞的增殖率,同时提高其凋亡率(P<0.05),而在MSI2过表达后,KGN细胞增殖率又有所提高,且凋亡率也有所降低(P<0.05),均接近于空白组。结论MSI2过表达能够有效缓解DHT诱导的KGN细胞增殖凋亡失衡现象,表明其在GCs生长和卵泡发育过程中发挥着重要作用。

生命科学跨学科整合实验教学的改革和探索

放线菌一直以来都是药物发现的重要来源。学习和掌握放线菌蕴含活性物质的发现、分离等相关专业知识和技能是医科院校生物技术专业的学生的基本要求。鉴于安徽医科大学微生物学实验存在的不足,该校细胞生物学教研室设计开展了以菌株资源为主线、实验技能培训为目的跨学科整合实验项目,以项目中药植物土大黄内生放线菌的分离、鉴定为例,采用线上线下混合式以及PBL教学模式,以学生为主体,并采用了相对细化和量化的考核体系对学生进行综合评价。该改革实践有效提升了学生的学习兴趣、动手操作能力、团队协作能力、逻辑思维能力、科研设计能力以及创新能力,可为相关课程改革提供参考。

人RB1及其突变体的表达与定位

目的研究人RB1及其缺失突变体蛋白在细胞内的表达与定位。方法以含人RB1全长cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法分别扩增出RB1全长及其三段缺失突变体序列,然后分别构建其表达载体,利用Western blot法和免疫荧光法检测其在细胞株中的表达与定位。结果成功构建了pCDNA3.1-FLAG-RB1及其缺失突变体的表达载体,Western blot法结果证明其在细胞中都能有效地表达,免疫荧光的结果显示了RB1主要分布在细胞核,但其缺失突变体在细胞质中也有分布。结论人RB1在HEK 293T、COS7细胞中均有表达,且主要分布在细胞核内,其缺失突变体在胞质中也有分布,这为进一步了解人RB1的功能提供了一定的基础。

医学本科生科研兴趣及影响因素的调查分析

目的:调查本校医学本科生的科研兴趣,并对影响科研兴趣的因素进行分析,为培养创新医学人才提供依据。方法:自行设计问卷,对我校在校医学本科生随机进行调查,回收问卷后进行统计,对影响科研兴趣的因素进行单因素分析。结果:回收有效问卷835份,其中45.27%的学生对科研非常感兴趣,50.18%的学生对科研一般感兴趣,仅有4.55%的学生对科研不感兴趣。影响学生科研兴趣的因素主要有专业、年级、对科研重要性的认识、参加科研的目的、开展实验的意愿、科研对毕业论文的帮助等(P<0.05),而学生的性别、年龄对科研兴趣没有影响(P>0.05)。结论:本校大部分学生对科研存在不同程度的兴趣,且临床专业学生、大一新生以及认为科研重要、科研目的明确、愿意开展实验的学生对科研的兴趣更浓厚。学校应优化学生培养模式,进一步提高学生的科研兴趣,提升学生综合素质,为社会医疗事业培养更优秀的人才。

医学细胞生物学实验课教学现状与改革措施

细胞生物学是现代医学的基础和支柱学科,实验教学是医学细胞生物学教学中的重要组成部分,但教学现状不容乐观。对学校医学细胞生物学实验课教学现状进行客观描述,分析教学过程中存在的主要问题,并针对性地从教学内容、教学模式、考核方式等几方面提出改革策略,旨在为今后提高医学细胞生物学实验课的教学质量提供建议。

人RACK1蛋白在HEK-293T和BL21细胞中的表达及COS7细胞的定位

目的构建可以表达有活性的蛋白激酶C受体(RACK1)的重组质粒,检测其在细胞内的表达与定位情况。方法设计上下游引物,以RACK1全长cDNA序列为模板,PCR扩增出RACK1序列,分别构建到载体pcDNA3.1和pGEX-5X-3。转染pcDNA3.1-FLAG-RACK1到人胚胎肾细胞(HEK-293T)和非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7细胞),转化pGEX-5X-3-RACK1到大肠杆菌BL21感受态细胞中表达,Western blot法和考马斯亮蓝染色法检测RACK1表达情况,免疫荧光法研究其细胞内定位。结果成功构建了pcDNA3.1-FLAG-RACK1和GEX-5X-3-RACK1重组质粒。Western blot证明了其在HEK-293T细胞中的表达,考马斯亮蓝染色显示其在BL21菌株也能大量表达,免疫荧光显示RACK1在COS7的细胞核与细胞质中均有分布。结论人RACK1在HEK-293T细胞和BL21菌株中均能有效表达,在COS7细胞的胞质、胞核均有分布,为进一步研究人RACK1基因的功能奠定了基础。

人MT2A基因在哺乳动物细胞株中的定位与表达

目的用基因克隆方法构建带FLAG-tag的人金属硫蛋白2A(MT2A)真核表达载体,用其转染HEK 293T,COS-7细胞观察MT2A在增殖细胞内的表达和定位。方法设计带FLAG-tag的引物,以人MT2A全长cDNA序列的质粒为模板,PCR法扩增MT2A全长序列,然后插入pCDNA 3.1中构建pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;将构建的质粒转染至HEK293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;脂质体法转染至COS-7细胞,荧光显微镜下观察MT2A表达的蛋白在细胞内定位。结果正确构建了pCDNA 3.1-MT2A-FLAG质粒;其在HEK 293T细胞中能有效地表达;免疫荧光实验表明在COS-7细胞中,MT2A主要分布在细胞质内。结论该研究结果为了解MT2A在细胞内与其他蛋白质相互作用及功能提供了一定的基础。

人β4GalTⅡ基因在哺乳动物细胞株中的表达与定位

目的运用基因克隆技术构建人源β1,4-半乳糖转移酶Ⅱ(β4Gal TⅡ)真核表达质粒,并将其转染到COS7细胞中,观察蛋白在细胞内的定位,同时转染到HEK 293T细胞中检测其表达。方法分别设计带FLAG标签和GFP标签的β4Gal TⅡ基因的特异性引物,以含人β4Gal TⅡ全长c DNA序列为模板,定向构建到pc DNA3.1(+)及p CDGFP真核表达载体中,构建重组表达质粒。通过酶切和测序鉴定阳性重组质粒,利用Lipofectamine 2000分别转染COS7、HEK 293T细胞,免疫荧光显微镜观察重组蛋白在细胞内的定位,Western blot法鉴定重组蛋白的表达。结果成功构建pc DNA3.1-β4Gal TⅡ-FLAG和p CDGFP-β4Gal TⅡ重组表达载体,定位实验表明:β4Gal TⅡ-FLAG和GFP-β4Gal TⅡ二者在COS7细胞中均主要定位在细胞核周围,并有明显的块状染色,胞核中未见明显分布;Western blot法检测显示重组β4Gal TⅡ蛋白在HEK 293T细胞中稳定表达。结论获得了人β4Gal TⅡ的真核表达质粒,并能在COS7和HEK 293T细胞中表达,为进一步研究β4Gal TⅡ的功能及其与其他蛋白的相互作用奠定了一定基础。

人E2F1蛋白的表达及与Sedlin蛋白共定位研究

目的研究人E2F1蛋白在真核细胞内的表达及其与Sedlin蛋白的共定位。方法构建pc DNA3.1-E2F1-FLAG真核表达质粒,然后瞬时转染至HEK 293T细胞内,Western blot法检测E2F1蛋白的表达;瞬时单转E2F1-FLAG和共转E2F1-FLAG+Sedlin-绿色荧光蛋白(GFP)至非洲绿猴肾细胞(COS7)内,免疫荧光制片,荧光显微镜下观察E2F1-FLAG在细胞内的定位及其和Sedlin的共定位。结果真核表达质粒pc DNA3.1-E2F1-FLAG构建成功,且在HEK 293T细胞中能够成功表达,在COS7细胞中主要定位在细胞核,且与Sedlin共定位于细胞核。结论人E2F1在HEK 293T、COS7细胞中都能够正常表达,且与Sedlin蛋白存在共定位现象,为进一步了解人E2F1的功能及其蛋白质相互作用提供了一定的细胞学基础。

鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒的构建及其部分功能研究

目的构建鼠源pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒,并观察其对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞中炎症相关因子分泌的影响及对RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响。方法通过PCR扩增NUP85基因,构建pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒。将pcDNA3.1-3×Flag-c载体进行酶切。纯化的PCR产物与载体连接,将连接产物转化细菌感受态细胞。酶切鉴定后,再进行测序和比对分析。然后将其转染至RAW264.7细胞中,通过CCK-8实验和流式细胞术检测其对LPS诱导的RAW264.7细胞增殖和凋亡的影响,并通过Western blot技术和ELISA法检测RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达情况。结果酶切鉴定和Western blot结果显示pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85真核表达质粒成功构建和表达。CCK-8实验结果显示:24 h后过表达NUP85组细胞的存活率显著低于对照组[(0.55±0.03)vs(0.67±0.05),F=30.98,P<0.05]。流式细胞术结果显示:过表达NUP85组细胞的凋亡率高于对照组[(15.78±1.05)%vs(13.40±0.47)%,F=75.38,P<0.05]。Western blot和ELISA结果显示:转染pcDNA3.1-3×Flag-c-NUP85质粒后,RAW264.7细胞中的TNF-α、IL-6表达较对照组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NUP85能够抑制LPS刺激的RAW264.7细胞的增殖并促进其凋亡,并且NUP85促进LPS刺激的RAW264.7细胞中炎症因子IL-6和TNF-α的表达。

肌营养不良蛋白及其衍生物的表达与定位的研究

目的研究肌营养不良蛋白(DG)及其衍生物α-DG、β-DG在真核细胞内的表达与定位。方法构建pcDNA3.1-DAG1-FLAG、pcDNA3.1-DAG1α-FLAG和pcDNA3.1-DAG1β-FLAG 3个真核表达质粒,并分别转染至HEK 293T细胞中;提取总蛋白,Western blot检测表达情况;分别转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察细胞定位情况。结果成功构建了带有DAG1、DAG1α、DAG1β基因的真核表达载体,且在HEK 293T细胞中都能有效表达,在COS7细胞中主要分布于细胞质。结论DG及其衍生物α-DG、β-DG在HEK293T、COS7细胞中均有表达,主要分布在细胞质内,为进一步了解DAG1的功能提供了细胞学基础。

FK506结合蛋白25及其突变体与CLIC1蛋白在真核细胞内共定位的研究

目的研究FK506结合蛋白25（FKBP25）野生型及其突变体在真核细胞内的表达、定位及与胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）的共定位情况。方法以pc DNA3.1-FKBP25-FLAG为模板,分别构建以p CDGFP为载体的FKBP25野生型及其缺失突变体FKBP25（1～42 aa）、FKBP25（1～110aa）、FKBP25（43～224 aa）、FKBP25（43～110 aa）、FKBP25（111～224 aa）的真核表达质粒,并分别转染至HEK 293T细胞中,Western blot法检测重组蛋白表达情况;将上述质粒分别与带FLAG标签的CLIC1质粒共转染至COS7细胞,激光共聚焦扫描显微镜下观察、分析荧光共定位情况。结果成功构建了p CDGFP-FKBP25基因的一系列真核表达质粒;Western blot显示：p CDGFP-FKBP25及其突变体p CDGFPFKBP25（1～42 aa）、p CDGFP-FKBP25（1～110 aa）、p CDGFPFKBP25（43～110 aa）、p CDGFP-FKBP25（43～224 aa）、p CDGFP-FKBP25（111～224 aa）均能在HEK 293T细胞中有效表达;GFP-FKBP25野生型在COS7细胞中主要分布在细胞质中,细胞核中表达较少,而突变体在细胞质、细胞核均有表达,而且细胞核中的表达多于野生型。共定位实验结果表明：野生型FKBP25蛋白与CLIC1蛋白在细胞质内存在明显的共定位现象。其3个缺失突变体与CLIC1蛋白的共定位明显减少,而且共定位也存在区别：FKBP25-N与CLIC1共定位主要于细胞核中,部分分布于细胞质;FKBP25-PC和FKBP25-C与CLIC1只共定位于细胞质中。结论荧光共定位实验观察到FKBP25野生型及其3种突变体FKBP25（1～42aa）、FKBP25（43～224 aa）、FKBP25（111～224 aa）与CLIC1蛋白存在不同程度的共定位现象,为进一步揭示FKBP25的生物学功能提供了基础。

CLIC1及其点突变体与Sedlin蛋白的共定位研究

目的构建胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)点突变体的真核表达质粒,进行CLIC1突变体的表达、定位及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)的共定位研究,为进一步揭示其功能奠定基础。方法以CLIC1全长c DNA序列为模板,构建3个真核表达质粒即pc DNA3.1-CLIC1(C24A)-FLAG、pc DNA3.1-CLIC1(C59A)-FLAG、pc DNA3.1-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG;Western blot法检测CLIC1及其点突变体在HEK 293T细胞中的表达;免疫荧光技术了解CLIC1及其点突变体蛋白在COS7细胞中的定位及与Sedlin的共定位情况。结果成功构建了CLIC1点突变体的真核表达质粒;Western blot结果显示3个点突变体蛋白在HEK293T细胞中均能表达,突变体的分子量低于野生型的;免疫荧光实验表明CLIC1蛋白在细胞质和细胞核都有表达,但主要在细胞核。CLIC1点突变体蛋白定位在胞质中,细胞核中无分布,与Sedlin蛋白在胞质存在共定位。结论CLIC1的3种点突变体均能在哺乳动物细胞中有效表达;CLIC1及其点突变体与Sedlin蛋白均存在共定位,提示两种蛋白之间可能存在相互作用。

人EBI3蛋白及其突变体的表达及定位研究

目的 研究人EB病毒诱导的基因3（EBI3）及其突变体在哺乳动物细胞中的表达及定位差异及其原因。方法 基于NCBI数据库中人EBI3氨基酸的序列分析,利用分子克隆技术构建人EBI3真核表达质粒pcDNA3.1-EBI3-FLAG、单独包含氨基端或羧基端Ⅲ型纤连蛋白（FN3）结构域的缺失突变体的表达质粒pcDNA3.1-EBI3（1~135）-FLAG和pcDNA3.1-EBI3（125~230）-FLAG以及第210位天冬氨酸（Asp）点突变体Asp210的表达质粒pcDNA3.1-EBI3-D210A-FLAG;Westernblot方法检测EBI3及其突变体在HEK293T细胞中的表达;免疫荧光实验观察人EBI3及各突变体在COS7细胞中的定位。结果 成功构建了下游携带FLAG标签的人EBI3及其突变体的真核表达质粒;Westernblot结果显示重组蛋白均能在HEK293T细胞中稳定表达;经激光共聚焦显微镜观察,EBI3及其缺失突变体在COS7细胞的表达位置发生明显变化。结论 人EBI3及其突变体真核表达质粒均能在HEK293T、COS7细胞中成功表达;人EBI3缺失突变体在COS7细胞中的定位发生明显变化,氨基端结构域可能在EBI3蛋白的正确定位中发挥重要作用;EBI3蛋白的第210位Asp的突变影响了其在细胞内的定位。

人FKBP3在哺乳动物细胞系中的转染表达与定位

以含cDNA序列的质粒为模板,下游引物带有FLAG标签,PCR扩增,插入pcDNA3.1,成功构建C端带FLAG标签的人野生型肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP3的哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-FKBP3-FLAG。转染HEK 293T细胞,Western blot检测;转染COS-7细胞,荧光显微镜观察。FKBP3在HEK 293T、COS-7细胞中均有表达,且定位在COS-7细胞的细胞质和细胞核,胞质分布较多,为进一步研究FKBP3的相互作用蛋白和功能奠定了一定的基础。

RACK1突变体在哺乳动物细胞中的表达及定位研究

目的根据活化蛋白激酶C受体1(RACK1)的蛋白结构,构建其缺失突变体的真核表达质粒,研究RACK1缺失突变体在真核细胞内的表达及定位改变。方法根据RACK1蛋白的结构域特点,以pc DNA3.1-RACK1-FLAG为模板,构建真核表达质粒pc DNA3.1-RACK1(51-317)-FLAG、pc DNA3.1-RACK1(93-317)-FLAG、pc DNA3.1-RACK1(135-317)-FLAG、pc DNA3.1-RACK1(180-317)-FLAG、pc DNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG;Western blot检测上述重组质粒在HEK 293T细胞中的表达;免疫荧光技术检测RACK1的各缺失突变体在COS7细胞中的定位情况。结果成功构建了RACK1各缺失突变体的真核表达质粒;Western blot结果表明,除pc DNA3.1-RACK1(219-317)-FLAG外,其余缺失突变体在HEK 293T细胞中均有效表达;免疫荧光实验表明RACK1缺失突变体在COS7细胞中主要定位在胞质,细胞核中也有少量分布。结论成功构建了RACK1缺失突变体真核表达质粒,并在HEK 293T和COS7细胞中成功表达;在COS7细胞中不同缺失突变体的表达定位均有差异,与野生型的RACK1相比也有所不同,表明缺失不同的结构域后其在细胞中的定位表达也发生了改变。这为研究RACK1各结构域的功能提供了重要依据。

通用转录因子GTFⅡF2对食管癌细胞增殖、迁移的影响

目的研究通用转录因子ⅡF多肽2(GTFⅡF2)的表达对食管癌细胞增殖及迁移的影响。方法人工合成靶向GTFⅡF2基因的siRNA序列和阴性对照siRNA序列及质粒pc DNA3.1-GTFⅡF2-FLAG,分别转染至食管癌细胞中,采用克隆形成实验和细胞划痕实验观察其对食管癌细胞增殖和迁移的影响。结果 RNA干扰技术靶向沉默GTFⅡF2基因表达后,食管癌细胞增殖和迁移均明显受到了抑制,而过表达GTFⅡF2对食管癌细胞的增殖和迁移无明显影响。结论GTFⅡF2基因在食管癌细胞TE-1、ECA-109的增殖和迁移过程中发挥重要作用,为进一步了解GTFⅡF2基因抑制TE-1、ECA-109细胞增殖和迁移的机制提供了基础。

FKBP25缺失突变体在细胞中的表达与定位

目的研究FKBP25缺失突变体蛋白在细胞内的表达和定位。方法以人FKBP25全长cDNA序列的质粒为模板,PCR方法分别扩增出FKBP25缺失突变体序列,然后插入真核表达载体pcDNA3.1中,通过Western blot方法和免疫荧光方法检测其在细胞株中的表达和定位。结果成功构建了FKBP25缺失突变体的真核表达载体,经Western blot检测FKBP25缺失突变体在HEK 293T细胞中能够有效表达,免疫荧光显微镜结果显示FKBP25缺失突变体在COS7细胞中分布于细胞核和细胞质。结论 FKBP25缺失突变体在HEK 293T、COS7细胞中能够表达,为了解FKBP25缺失突变体的功能提供了一定基础。

人MRG15在哺乳动物细胞中表达与定位的初步研究

目的研究细胞周期调控蛋白(MRG15)在哺乳动物细胞中的表达与定位。方法以含人MRG15全长cDNA序列的质粒为模板,PCR扩增,构建MRG15真核表达载体,分别利用Western blot法和免疫荧光法检测其在哺乳动物细胞株中的表达与定位。结果 Western blot法检测结果表明MRG15在哺乳动物细胞中能有效地表达,免疫荧光法结果显示MRG15主要分布在细胞核。结论 MRG15蛋白主要在细胞核中表达,为进一步了解MRG15的功能奠定了一定基础。

细胞内氯离子通道蛋白2的定位与表达

目的研究细胞内氯离子通道蛋白2(CLIC2)在细胞中的定位与表达。方法以含人CLIC2全长cDNA序列的菌液为模板,PCR法构建CLIC2真核表达载体,利用免疫荧光和Western blot法检测其在细胞株中的定位与表达。结果细胞免疫荧光结果显示CLIC2在细胞质、细胞核中均有分布;Western blot的结果证明其在细胞中能有效地表达。结论 CLIC2蛋白在细胞质和细胞核中均大量分布,为进一步了解CLIC2的功能奠定了基础。