核仁素诱导自噬促进乳腺癌细胞增殖的作用机制

目的核仁素Nucleolin(NCL)与多种肿瘤的发生发展密切相关,也是抗肿瘤的重要靶点。文中旨在研究NCL蛋白促进乳腺癌细胞增殖的机制,为乳腺癌的治疗提供新的靶点及治疗策略。方法NCL过表达实验分为4组:4TO组(细胞转染pcDNA/4T0空载体)、4TO-NCL组(细胞转染4TO-NCL过表达载体)、4TO+Rapamycin组(细胞转染pcDNA/4T0后加入雷帕霉素处理)、4TO-NCL+Rapamycin组(细胞转染4TO-NCL过表达载体后加入雷帕霉素处理)。NCL敲低表达实验也分为4组:siRNA组(细胞转染对照siRNA)、NCLsiRNA组(细胞转染NCL siRNA)、siRNA+Rapamycin组(细胞转染siRNA后加入雷帕霉素处理)、NCLsiRNA+Rapamycin组(细胞转染NCL siRNA后加入雷帕霉素处理)。分别检测NCL过表达和敲低表达对乳腺癌细胞自噬相关蛋白表达的影响。NCL对自噬小体形成的影响,实验分为4组:GFP组(转染带有绿色荧光蛋白标签的GFP空载体)、GFP-NCL组(转染带有绿色荧光的NCL融合蛋白的GFP-NCL质粒)、GFP+Rapamycin组(转染带有绿色荧光蛋白标签的GFP空载体24 h后,加入Rapamycin处理细胞12 h)、GFP-NCL+Rapamycin组(转染带有绿色荧光的NCL融合蛋白的GFP-NCL质粒24 h后,加入Rapamycin处理细胞12 h)。NCL过表达实验分为4组:pcDNA/4T0组(细胞转染pcDNA/4T0空载体)、pcDNA/4T0-NCL过表达组(细胞转染4TO-NCL过表达载体)、pcDNA/4T0+3-MA组(细胞转染pcDNA/4T0空载体质粒后加入3-MA处理)、pcDNA/4T0-NCL+3-MA组(细胞转染4TO-NCL过表达载体后加入3-MA处理)。NCL敲低表达实验也分为4组:siRNA组(细胞转染对照siRNA)、NCL siRNA组(细胞转染NCL siRNA)、siRNA+3-MA组(细胞转染siRNA后加入3-MA)、NCLsiRNA+3-MA组(细胞转染NCL siRNA后加入3-MA)。MTT实验、EdU实验及细胞划痕实验检测NCL对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。结果免疫印迹结果显示,4TO-NCL过表达组与4TO组相比,P62的表达降低,Beclin的表达水平明显升高。MTT结果显示,与4T0组细胞活力(103.60±2.88)相比,4T0-NCL组(116.70±3.34)相对增强(P<0.05);pcDNA/4T0+3-MA组、pcDNA/4T0-NCL+3-MA组细胞活力(54.61±11.59、67.02±13.21)较pcDNA/4T0组、pcDNA/4T0-NCL组明显减弱(P<0.05)。NCL敲低表达得到了相反的结果。EdU实验结果与MTT结果一致。pcDNA/4TO-NCL组细胞的迁移率明显强于pcDNA/4TO组(P<0.0001);pcDNA/4TO-NCL+3-MA组细胞的迁移率较pcDNA/4TO-NCL组明显下降(P<0.05)。结论NCL蛋白与乳腺癌密切相关,并通过诱导自噬促进细胞的增殖,NCL作为乳腺癌诊断及治疗的重要靶点对临床应用具有重要意义。