Fas/caspase-8/3和ERK信号通路在Fas siRNA减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用

目的评价Fas/caspase-8/3和细胞外信号调节激酶(extracellular signaling-regulated kinase,ERK)信号通路在Fas siRNA减轻心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤中的作用。方法培养H9c2心肌细胞,随机分为4组(n=3):(1)正常对照组:H9c2细胞置于DMEM/F12细胞培养液中培养;(2)H/R组:将H9c2细胞进行5 h缺氧和1 h复氧处理;(3)Fas siRNA组(H/R+Fas-siRNA):H9c2细胞转染Fas siRNA 24 h后进行H/R损伤;(4)siRNA阴性对照组(H/R+siRNA-NC):H9c2细胞转染Fas siRNA-NC 24 h后进行H/R损伤。处理结束后,采用CCK-8法检测细胞活力;微量酶标法测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;荧光定量RT-PCR法检测细胞Fas mRNA表达水平;Western blot法检测细胞内Fas、caspase-8/3、ERK和GSK-3β蛋白表达。结果与对照组相比,H/R组细胞活力降低,LDH活性和细胞凋亡增加,Fas mRNA及蛋白水平升高,cleaved caspase-8/3、p-ERK、p-GSK-3β蛋白表达升高(P<0.05);与H/R组相比,H/R+FassiRNA组细胞活力明显提高,LDH活性和细胞凋亡率降低,Fas mRNA及蛋白表达水平降低,cleaved caspase-8/3蛋白表达降低,p-ERK、p-GSK-3β蛋白表达增高(P<0.05),而H/R+siRNA-NC组上述指标差异无统计学意义。结论 Fas/caspase-8/3和ERK信号通路在Fas siRNA减轻心肌细胞H/R损伤中发挥着重要作用。

甲状旁腺自体移植术患者右美托咪定镇静的熵指数变化

目的：评价熵指数在监测右美托咪定用于慢性肾衰继发甲旁亢行甲状旁腺自体移植术患者全麻诱导前镇静深度的变化特点。方法：试验组（E组）为择期行甲状旁腺全切除术的慢性肾衰患者20例,ASAⅡ~Ⅲ级,年龄18~65周岁,体质量指数18~25 kg/m2;对照组（C组）为择期行甲状腺腺瘤切除术的一般患者20例,ASAⅠ~Ⅱ级且无系统性疾病。两组在麻醉诱导前均输注负荷剂量0.9 m L·kg^-1·h^-1的右美托咪定10 min（右美托咪定浓度为4μg/m L）,然后开始麻醉诱导。分别于输注前（T0）、输注1 min（T1）、5 min（T2）、7 min（T3）、11 min（T4）时记录反应熵（RE）、状态熵（SE）并计算RE-SE的值。结果：与T0相比,E组在T4时的RE和SE均下降（P〈0.05）;与C组相比,E组在T4时的RE和SE较低（P〈0.05）,且E组的RE-SE在T3时同样低于C组。结论：在右美托咪定用于全麻诱导前镇静时,甲状旁腺自体移植术患者的熵指数较一般患者明显降低。

吗啡预处理诱导的大鼠血清外泌体对H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的探讨吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)诱导的大鼠血清外泌体对H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的影响。方法大鼠进行MPC或对照处理(CON)后,提取血清中的外泌体,标记为MPC-Exo、CON-Exo。利用透射电镜和Western blot进行外泌体鉴定。H9c2心肌细胞随机分为Control组、H/R组、H/R+CON-Exo组和H/R+MPC-Exo组。除Control组细胞常规培养外,其余各组细胞均给予5 h缺氧和1 h复氧处理,H/R+CON-Exo组和H/R+MPC-Exo组细胞在H/R损伤前,分别与相应外泌体共孵育12 h。分别检测细胞活力、乳酸脱氢酶(lactic acid dehydrogenase, LDH)活性和细胞凋亡。结果外泌体提取物电镜下呈直径30～100 nm的圆形囊泡,并表达外泌体标志性蛋白。MPC-Exo与H9c2心肌细胞共孵育,可以明显减轻心肌细胞H/R损伤,增强细胞活力,减少LDH释放,并抑制心肌细胞凋亡;相反,CON-Exo与心肌细胞共孵育后,对H/R损伤无明显影响。结论 MPC诱导的大鼠血清外泌体可减轻H9c2心肌细胞H/R损伤,发挥心肌保护作用。

慢病毒介导的NGF基因沉默对PC12细胞分化的影响

目的探讨慢病毒介导的神经生长因子(nerve growth factor,NGF)基因沉默后对大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(pheochromocytoma cell,PC12)分化的影响及其机制。方法构建NGF shRNA慢病毒载体。培养PC12细胞,随机分为5组(n=3):1正常对照组(NC):PC12细胞置于DMEM/HG细胞培养液和促感染试剂polybrene中培养;2空病毒感染组(LV CON):PC12细胞置于空病毒和polybrene中培养;3慢病毒NGF shRNA1感染组(LV sh NGF1):PC12细胞置于慢病毒NGF shRNA1和polybrene中培养;4慢病毒NGF shRNA2感染组(LV sh NGF2):PC12细胞置于慢病毒NGF shRNA2和polybrene中培养;5慢病毒NGF shRNA3感染组(LV sh NGF3):PC12细胞置于慢病毒NGF shRN3和polybrene中培养。处理结束后,荧光显微镜下检测感染效率、荧光定量RT-PCR法检测细胞NGF mRNA表达水平、Western blot法检测慢病毒感染后细胞NGF、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)和磷酸化-ERK1/2(phosphorylated ERK1/2,p-ERK1/2)蛋白表达,细胞增殖检验试剂(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞活性,显微镜下观察PC12细胞形态,统计细胞突起长度和最大细胞直径。结果慢病毒感染PC12细胞的效率超过90%。与NC组相比,LV sh NGF3组NGF mRNA表达降低(P<0.05),NGF蛋白水平明显降低(P<0.05),ERK1/2蛋白表达和细胞活性无差异,p-ERK1/2蛋白表达有明显下降(P<0.01),细胞形态发生明显变化,细胞突起长度和最大细胞直径均变小(P<0.01),细胞分化被抑制。结论慢病毒介导的NGF基因沉默通过抑制ERK1/2活化,影响PC12细胞分化。

吗啡预处理对心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死的影响

目的评价吗啡预处理对心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤时程序性坏死的影响。方法清洁级健康成年雄性SD大鼠,体重200~230 g,尾静脉注射盐酸多柔比星2 mg/kg,1周1次,连续6周,制备慢性心力衰竭模型,在第8周末将造模成功的30只大鼠采用随机数字表法分为3组(n=10):假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和吗啡预处理组(MPC组)。采用开胸结扎左冠状动脉前降支(LAD)缺血30 min、恢复灌注的方法制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型。S组只缝线,不结扎LAD,其余各组均结扎LAD。MPC组于缺血前股静脉输注吗啡0.1 mg/kg,输注5 min后停止输注5 min,重复3次后进行制备模型。于再灌注120 min时处死大鼠取心脏,采用TTC染色检测梗死区体积(IS)、缺血危险区体积(AAR),计算IS/AAR比值,荧光定量RT-PCR法检测Fas mRNA表达,Western blot法检测Fas、受体相互作用蛋白1(RIP1)和RIP3表达。结果与S组比较,I/R组再灌注120 min时IS和IS/AAR比值增加,Fas及其mRNA、RIP1和RIP3表达上调(P<0.05);与I/R组比较,MPC组再灌注120 min时IS和IS/AAR比值减少,Fas及其mRNA、RIP1和RIP3表达下调(P<0.05)。结论吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制与抑制程序性坏死有关。

μ受体在吗啡预处理减轻慢性心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用：离体实验

目的评价斗受体在吗啡预处理减轻慢性心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法雄性成年SD大鼠，体重170～230g，采用尾静脉注射盐酸多柔比星的方法制备慢性心力衰竭模型。采用Langendorff模型制备离体心脏灌注模型。取慢性心力衰竭大鼠离体灌注模型制备成功的心脏40个，采用随机数字表法分为4组（n=10）：缺血再灌注组（I／R组）、吗啡预处理组（MP组）、“受体拮抗剂CTOP＋吗啡预处理组（CTOP＋MP组）和CTOP组。采用结扎左冠状动脉前降支30min，恢复灌注120min的方法制备离体心脏缺血再灌注损伤模型。MP组先平衡灌注K—H液15min，随后灌注含1μmol／L吗啡的K．H液5min，再次灌注K．H液5min，共3个循环，然后制备离体心脏缺血再灌注损伤模型。CTOP＋MP组于吗啡预处理前10min至缺血5min，灌注含1la,mol／LCTOP的K．H液。CTOP组于缺血前40min至缺血5min灌注含1p,mol／LCTOP的K_H液。于稳定灌注15min（基础状态）、再灌注5和10min时收集冠状动脉流出液，采用化学比色法检测LDH活性。再灌注120min时，采用1Trc染色法确定缺血危险区体积（AAR）、梗死区体积（IS）及IS／AAR百分比。再灌注10min时采用qRT。PCR法检测心肌Bcl-2和Bax的mRNA表达，并计算Bcl-2／Bax比值。结果与I／R组比较，MP组IS和IS／AAR百分比降低，冠状动脉流出液LDH活性降低，心肌BaxmRNA表达下调，Bcl．2mRNA表达上调，Bcl-2／Bax比值升高（P〈0．05），CTOP组和CTOP＋MP组IS和IS／AAR百分比差异无统计学意义（P〉0．05）：与MP组比较，CTOP＋MP组IS和IS／AAR百分比升高，冠状动脉流出液LDH活性升高，心肌BaxmRNA表达上调，Bcl-2mRNA表达下调，Bcl-2／Bax比值降低（P〈0．05）。结论吗啡预处理减轻慢性心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤的机制可能与激活心肌μ受体，从而维持Bcl-2／Bax基因表达平衡有关。