大鼠抗肠道病毒71型衣壳蛋白VP1特异性中和单克隆抗体的研制与应用

目的研制大鼠抗肠道病毒71型（EV71）衣壳蛋白VPl特异性中和单克隆抗体（单抗），并用Westem印迹、ELISA和免疫荧光检测（IFA）等方法验证其特异性。方法采用单克隆杂交瘤技术人工合成包含EV71 VP1中和抗原决定簇位点SPT0的多肽偶联载体蛋白KLH，腹腔内注射免疫大鼠数次后，取有预期免疫应答的脾细胞与SP2／0小鼠骨髓瘤细胞融合，用间接ELISA法筛选和有限稀释法亚克隆获得稳定的阳性单克隆杂交瘤细胞株并鉴定其IgG亚型。选取其中1株单克隆杂交瘤细胞系BC6，体外培养后注射于SCID裸鼠腹腔制备腹水以产生大量抗体，用ProteinA层析柱亲合纯化后获得纯化抗体。细胞培养微量中和试验测定该单抗中和EV71的滴度，并将其用于多种方法检测EV71特异性抗原。结果共获得8株稳定的单克隆杂交瘤细胞系，分别有6株属于IgGl亚型，2株为IgG2a亚型。通过制备腹水大量产生抗EV7l大鼠单抗BC6并纯化，其对EV71的中和滴度为1：32。BC6用于Western免疫印迹可特异检测大肠埃希菌表达的EV71VPl重组蛋白和EV71样品中的VPl，用于ELISA可灵敏特异地定性或定量检测EV71抗原含量，用于IFA可特异识别被感染Vero细胞内的EV71颗粒，而对柯萨奇病毒A16型无交叉反应。结论成功制备获得了大鼠抗EV71VPl的特异性中和单抗，可应用于Western免疫印迹、ELISA、IFA等方法，成为灵敏特异地检测EV71VPl或全病毒颗粒的有效工具。

HEK293细胞的传代、建库与高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒的研究

目的对HEK293细胞进行三级细胞库的建立,并高效表达重组的HPV16-E6E7腺病毒。方法进行HEK293细胞传代培养,并建立三级细胞库,按中国药典2010年版III部要求进行常规检验;培养重组HPV16-E6E7腺病毒,测定滴度,插入目的基因以及基因组酶切图谱鉴定。结果 HEK293细胞传代符合其生长形态,建立的三级细胞库和不同细胞库之间的传代数,细胞浓度和装量均符合疫苗基质制备的要求;能高效表达重组HPV16-E6E7腺病毒,种子滴度>3.0×109 IU·m L?1;表达的目的基因和目的蛋白稳定。结论建立的HEK293三级细胞库符合疫苗用细胞基质的要求。

人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗酶联免疫检测法的建立及其应用

目的建立人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗（HPV16 L2E6E7）酶联免疫的检测方法,用于疫苗发酵过程中的重组蛋白表达的监控。方法用常规方法制备兔抗HPV16 L2E6E7多克隆抗体作为包被抗体,商品化小鼠抗HPV16 E7单克隆抗体为检测抗体,夹心ELISA方法检测HPV16 L2E6E7抗原参考品,建立抗原标准曲线,确定线性范围及检测限,同时验证该方法的特异性。结果建立了检测HPV16 L2E6E7抗原含量的夹心ELISA方法,抗原参考品系列浓度在19.53~1 250 ng·m L-1内有很好的线性（R2〉0.99）和回收率（90%~110%）;特异性好,不受发酵液中宿主菌蛋白的干扰。结论建立了人乳头瘤病毒重组蛋白疫苗重组抗原含量的测定方法,为该疫苗的发酵工艺的质控提供了有效技术手段。

铝吸附甲型肝炎灭活疫苗抗原解离方法研究

目的建立铝吸附甲型肝炎（甲肝）灭活疫苗中甲肝病毒（HAV）抗原的解离方法。方法选择20％二乙醇胺1．25mL、10％TritonX．1000．2mL和PBS8．55mL混合液作为解离液A；pH7．2的3％（w／v）柠檬酸缓冲液作为解离液B；20％（w／v）柠檬酸三钠为解离液C。分别检测3种解离液在不同的解离条件下对铝佐剂甲型肝炎灭活疫苗的解离情况，用ELISA法检测解离后的HAV抗原含量，计算抗原回收率，确定最佳解离液及解离条件，并验证其可重复性。结果3种解离液HAV抗原解离试验显示，解离液C在室温（20~28℃）条件下解离1h，HAV抗原的回收率最高，可达95％及以上，重复试验的变异系数均〈10％。结论20％（w／v）柠檬酸三钠可作为铝佐剂甲肝灭活疫苗的首选抗原解离剂，该解离剂配方简单，操作简便，结果重复性好，准确度高。