微小隐孢子虫黏蛋白CGD5_2060原核表达及其黏附功能

从微小隐孢子虫c DNA中克隆黏蛋白cgd5_2060基因,并对其蛋白功能相关基序进行预测;构建原核表达载体p ET32a-cgd5_2060,转化至大肠埃希菌Rosetta中,诱导表达并纯化重组蛋白CGD5_2060,制备鼠源多克隆抗体,并通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定其抗体效价;将纯化的重组蛋白CGD5_2060及载体对照蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法(Western blotting)与间接ELISA方法检测其细胞黏附特性。结果表明,CGD5_2060蛋白的1~19个氨基酸为信号肽,说明该蛋白是分泌型蛋白。使用PROSITE数据库分析发现:该蛋白含有1个富含苏氨酸的区域TTTTTTKSTTTTTTAVTT,位于510~527个氨基酸处;此外,还有1个与细胞黏附有关的序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),位于69~71个氨基酸处。上述结果表明,cgd5_2060基因可能与微小隐孢子虫黏附宿主细胞相关。原核表达的重组蛋白CGD5_2060具有良好的免疫原性,获得了较高效价的多克隆抗体。重组蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法与间接ELISA方法检测发现,CGD5_2060可以与Caco2细胞黏附。本试验为揭示微小隐孢子虫黏附细胞的机制提供了一定的理论基础。

弓形虫SAG1重组抗体制备及抗原表位鉴定

重组抗体相较于多克隆抗体和杂交瘤单克隆抗体具有更好的稳定性和特异性,本研究以弓形虫表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)为靶标制备了重组抗体。将弓形虫SAG1(45~198aa)的基因序列被克隆到pET-32a原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21感受态细胞后获得弓形虫SAG1(45~198aa)重组蛋白。重组蛋白经镍柱纯化后通过皮下注射免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,制备SAG1单克隆杂交瘤。通过兼并引物克隆杂交瘤抗体的重链和轻链序列得到重组抗体表达质粒,将重组抗体表达质粒转染HEK293T细胞获得重组抗体。通过pET-32a和pCMV-EGFP质粒表达SAG1多肽片段鉴定重组抗体识别的SAG1抗原表位。结果显示,免疫印迹和免疫荧光试验确定SAG1重组抗体的特异性,SAG1重组蛋白的抗原表位序列为SAG1(84~90aa)。本研究展示了一种简便的重组抗体制备过程,可为其他蛋白的抗体制备提供借鉴,制备的重组抗体具有详细抗原表位信息,有望成为弓形虫诊断的工具抗体。

检测猪弓形虫ROP14抗体间接ELISA方法的建立

为丰富和完善弓形虫病的检测方法,本试验基于弓形虫棒状体蛋白14(TgROP14)建立了间接ELISA检测方法。构建原核表达载体pET30α-ROP14,转化至大肠杆菌BL21中,诱导表达并纯化获得TgROP14重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot试验验证其纯度及免疫原性。利用纯化透析后复性的rTg-ROP14建立猪弓形虫病间接ELISA检测方法,并对反应中各项条件进行了优化。结果表明最佳检测条件为:抗原包被量2μg/孔,血清稀释倍数为1∶20,封闭剂为5%脱脂奶粉,血清作用时间为60 min,二抗稀释倍数为1∶1 000,二抗作用时间为60 min,TMB作用时间为20 min,临界值为0.728。该方法敏感性为1∶80,批内批间重复试验变异系数均小于10%,重复性较好;使用该方法检测猪繁殖与呼吸综合征(美洲型)阳性血清、猪O型口蹄疫阳性血清、猪A型口蹄疫阳性血清和猪瘟阳性血清均未见交叉反应,特异性较好。利用该方法对来自浙江省各个地区的436份猪血清样品进行检测,同时使用商品化的间接血凝试剂盒进行验证,符合率为72.7%(317/436)。综上所述,本试验建立的间接ELISA方法可用于临床样品的检测,为猪弓形虫病的血清流行病学调查提供了依据。

柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白重组枯草芽孢杆菌的构建与鉴定

旨在通过芽孢表面展示技术构建柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白的重组枯草芽孢杆菌,为防控鸡球虫感染提供新思路。首先从柔嫩艾美耳球虫和枯草芽孢杆菌基因组中分别扩增EtMIC2基因和芽孢衣壳蛋白编码基因CotB,通过重叠PCR技术将两者融合后克隆至pDG364中,构建整合型重组质粒pDG364-CotB-EtMIC2,并通过电转化将融合基因CotB-EtMIC2整合于枯草芽孢杆菌amyE基因位点,最后利用PCR、Western blot和免疫荧光等技术进行鉴定。结果显示,成功克隆目的基因EtMIC2,与锚定元件CotB融合成功,且定点整合于枯草芽孢杆菌基因组,融合蛋白正确表达并可在芽孢表面检测到特异性荧光信号。本研究成功构建能够表面展示EtMIC2蛋白的重组枯草芽孢杆菌,可用于后续评估其抗球虫免疫保护效果。