两株H6亚型禽流感病毒全基因组序列测定及遗传进化分析

为研究2016年在活禽交易市场鸭体内分离的2株H6亚型禽流感病毒(AIV)[分别是A/duck/Jiangxi/88/2016(H6N6)(简称DK/88/16)和A/duck/Jiangxi/219/2016(H6N2)(简称DK/219/16)]分子特征及遗传进化规律,本实验对其进行了全基因组扩增和测序,并进行了遗传进化分析。结果显示,2株病毒间HA基因同源性较低,仅为94.5%,但与我国近年分离的H6亚型病毒株保持较高同源性。DK/88/16和DK/219/16的NA基因分别与我国近年流行的流感病毒N6和N2基因保持较高同源性。对2株病毒的内部基因分析显示,其内部基因的来源较为复杂,其中DK/88/16的内部基因PA来源于我国最近流行的H5N2或H5N6病毒,显示该株病毒为新的重组病毒。对2株病毒的分子特征分析显示,除M1蛋白的30和215位点及NS1蛋白的42位点具有增强病毒对小鼠致病力的分子特征外,其余均保持低致病力分子特征。以上结果表明,H6N2和H6N6亚型AIV在我国鸭群中持续存在,并不断的遗传重组,需要进行持续的流行病学监测。

增强型猫ω干扰素的筛选及抗病毒活性分析

为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物。以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载体pLVX-IRSE,构建重组质粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、p LVX-FeIFN-ω-T188R。4个重组质粒分别与包装质粒psPAX2和膜蛋白质粒pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,48 h后收获细胞上清即为慢病毒。分别将4个慢病毒转导293悬浮细胞(293s),扩大培养后收获细胞上清,经镍离子亲和层析柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE检测、BCA法测蛋白浓度。结果显示,rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R在293s细胞中得到高效表达,且蛋白纯化效果好;经BCA法测浓度,4种重组蛋白浓度均约为200μg/mL,即获得了重组干扰素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R。4种重组干扰素分别经猫肾细胞(CRFK)孵育18 h后接种猫杯状病毒(FCV)或猫疱疹病毒(FHV)12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素抗FCV和FHV活性;4种重组干扰素分别经CRFK细胞孵育12 h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1的转录水平,结果显示:实验组与空白对照组差异极显著(P<0.01),实验组中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R与rFeIFN-ω均差异不显著(P>0.05)或表现为活性降低,rFeIFN-ω-T188R与rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R差异均显著(P<0.05)表现为活性增强,并且r FeIFN-ω-T188R抗病毒活性及诱导ISGs的转录水平均比rFeIFN-ω高1倍左右。选择r FeIFN-ω和rFeIFN-ω-T188R分别与His纯化树脂结合,加入等量表达干扰素受体(IFNAR1/R2)的重组质粒转染293T细胞的裂解液,4℃结合过夜,经western blot鉴定干扰素与IFNAR1/R2结合亲和力分析,结果显示,rFeIFN-ω-T188R与IFNAR1的结合能力比r FeIFN-ω高1倍左右,且两者与IFNAR2的结合能力差异不显著。本研究成功筛选到增强型rFeIFN-ω-T188R,为研究高效FeIFN-ω药物奠定了基础。

US3/US7/US8/UL23/UL50基因缺失重组伪狂犬病病毒的构建及对犬致病性分析

自2011年以来,伪狂犬病(PR)在我国猪群中暴发,为控制PR的传播,基于流行的变异株研制了US7/US8/UL23缺失重组伪狂犬病病毒(rPRV)疫苗。疫苗可以对猪提供有效的免疫保护,但由于食用被污染的生肉或免疫猪的内脏,毛皮动物如犬、狐狸、水貂等越来越多地受到PRV弱毒疫苗株的感染,该感染对于毛皮动物是致死性的。本研究以rPRV^(delUS7/US8/UL23)为基础,利用CRISPR/Cas9介导的同源重组技术构建rPRV^(delUS7/US8/UL23/US3/UL50);比较了rPRV^(delUS7/US8/UL23)(三缺失)和rPRV^(delUS7/US8/UL23/US3/UL50)(五缺失)的体外生长动力学和对犬致病性。结果显示,重组病毒rPRV^(delUS7/US8/UL23/US3/UL50)在感染后24~48 h的生长动力学低于rPRV^(delUS7/US8/UL23)。此外,rPRV^(delUS7/US8/UL23)感染细胞可产生细胞融合现象,而^(rPRVdel US7/US8/UL23/US3/UL50)感染细胞未形成细胞融合。US7/US8/UL23缺失rPRV攻毒的犬表现出明显的神经症状,所有犬均死亡,但用US7/US8/UL23/US3/UL50缺失rPRV攻毒的犬未表现出任何神经症状,所有犬在试验期间均存活。组织病毒载量分析并未显示出明显差异。本研究结果表明,US7/US8/UL23/US3/UL50缺失的rPRV对犬无致病力,同时也凸显了US3、UL50基因在PRV感染犬等毛皮动物呈现高毒力中的作用,为研发更安全的疫苗提供了策略。