柑橘黄龙病菌双重实时荧光PCR检测方法的建立

建立基于双重荧光定量PCR检测柑橘黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)的方法,并对其准确性进行验证。通过受试者工作特征(ROC)曲线、净重分类改善指数(NRI)和综合判别改善指数(IDI)分析7对CLas实时荧光PCR引物及其联合检测的准确性,评价RNRf/RNRr联合CLas-4G/HLBr的双重实时荧光PCR对CLas的检测价值。ROC曲线分析结果显示,表现最好的引物是RNRf/RNRr,其曲线下面积(AUC)为0.971,高于其他6对引物;其次是CLas-4G/HLBr引物,AUC为0.966;在双引物联合检测中,RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测、CQULA04F/CQULA04R+RNRf/RNRr引物并联检测的相关性能指标较优,AUC分别为0.963和0.966,并且RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr引物串联检测同时具备较高的敏感性(85.19%)和特异性(99.25%)。NRI分析结果表明RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr串联检测的诊断能力相较于LJ900f/LJ900r的单一引物实时荧光PCR显著提升了6.00%(P<0.05)。使用RNRf/RNRr和CLas-4G/HLBr两对引物进行双重实时荧光PCR,发现RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr双重实时荧光PCR比单一引物实时荧光PCR有更高的灵敏度。因此,RNRf/RNRr+CLas-4G/HLBr双重实时荧光PCR可作为柑橘黄龙病低发区的早期诊断工具。