商品疫苗对我国h9.4.2.5分支H9N2亚型禽流感分离株的免疫保护

【目的】我国批准使用的H9亚型禽流感(avian influenza,AI)商品化灭活疫苗种类繁多,其免疫效果和选用受到养殖者的广泛关注。通过评估不同商品疫苗对我国近期H9N2亚型AIV的免疫保护效果,以期为H9亚型AIV的免疫防控提供科学参考。【方法】依据国家兽药基础数据库疫苗批签发数据,从在售的40种H9亚型AI商品疫苗中选择批签发数量较多的4种疫苗(A—D疫苗),进行免疫攻毒试验。4株h9.4.2.5分支的H9N2亚型分离株CK/XJ/S1204/2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/NX/S4590/2020为攻毒毒株,分别测定4株病毒的鸡胚半数感染量(EID_(50))、鸡半数感染量(CID50)和细胞半数感染量(TCID50),以确定动物试验的攻毒剂量和细胞试验的感染剂量。每种疫苗以产品推荐剂量免疫3周龄SPF鸡各40只,同时设同日龄SPF鸡40只接种PBS作为对照组;免疫3周时,采集所有试验鸡血清,测定血凝抑制抗体(HI)和中和抗体(NT)滴度;同时将每种商品疫苗接种40只SPF鸡进行随机分组,每组10只,连同10只对照组鸡,以10 CID50的剂量鼻腔感染H9N2亚型分离株,分别进行商品疫苗对4株病毒的攻毒保护试验。采集攻毒后3、5 d喉头及泄殖腔棉拭子样品,接种10日龄鸡胚检测排毒情况,统计疫苗保护率,比较疫苗对H9N2亚型分离株的免疫保护效果。【结果】4株H9N2亚型分离株的CID50依次为10^(3.5)、10^(2.5)、10^(2.5)和10^(3.5)EID_(50)/0.1 mL。商品疫苗接种后3周,各免疫组SPF鸡血清中针对商品化H9亚型HI试验抗原(CK/SH/10/2001)的HI抗体均在9.4 log_(2)—11 log_(2)之间,但针对攻毒株的HI抗体平均效价在4.6 log_(2)—10.8 log_(2)之间,不同疫苗免疫组间存在较大差异,最大差异为64倍,各免疫组NT抗体平均效价在6.7 log_(2)—12.2 log_(2)之间,最大差异为32倍,对照组鸡的HI抗体和NT抗体均为阴性。以滴鼻方式感染不同H9病毒后,4种疫苗的免疫保护效果存在较大差别,在攻击CK/XJ/S1204/2015毒株的试验中,3种疫苗(B—D疫苗)能为免疫鸡提供80%以上保护;在攻击DK/JX/S4512/2017毒株试验中,仅1种疫苗(B疫苗)能为免疫鸡提供80%以上保护;在攻击CK/YN/S1666/2020毒株的试验中,2种疫苗(A和B疫苗)能为免疫鸡提供80%以上免疫保护;而攻击CK/NX/S4590/2020毒株,4种疫苗免疫鸡的保护率均低于80%,而同期各对照组鸡均排毒,排毒率均高于80%。【结论】不同商品疫苗预防近期H9亚型分离株感染的免疫保护效果存在较大差异,疫苗抗原与分离株之间的抗原性差异是免疫保护率降低的主要原因;使用H9N2亚型流行毒株测定免疫后的HI抗体和NT抗体可作为评价商品疫苗免疫保护效果的重要依据。本研究为商品H9疫苗的科学选用提供重要参考。

禽流感(H5+H7)重组杆状病毒载体三价灭活疫苗对家禽的免疫效力研究

为评估禽流感(H5+H7)重组杆状病毒载体三价灭活疫苗(rBH5-11株+rBH5-12株+rBH7-2株)对家禽的免疫保护效果,本研究将制备的3批疫苗接种21日龄SPF鸡,并进行疫苗的效力检测及H5和H7亚型禽流感病毒(AIV)流行株的攻毒试验;同时将该疫苗接种商品蛋鸡和鸭,进行免疫抗体持续期研究。疫苗免疫效力试验结果显示,3批疫苗常规剂量(0.3 mL/只)分别接种SPF鸡后3周,免疫鸡血清中针对H5亚型Re-11株和Re-12株、H7亚型H7-Re2株AIV的平均HI抗体效价为7.9 log2~8.5 log2,对照组鸡血清中针对3种抗原的HI抗体均为阴性;用H5N6、H5N1和H7N9亚型AIV分别攻毒后10 d观察期内,对照鸡均全部发病死亡,所有免疫组鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得100%的免疫保护。流行株的效力试验结果显示,免疫后3周,接种常规剂量(0.3mL/只)疫苗鸡血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在7.9 log2以上,使用2株H5N6亚型AIV、2株H5N1亚型AIV及1株H7N9亚型AIV和1株H7N2亚型AIV流行株攻毒后,各免疫组鸡均获得100%的免疫保护。抗体持续期试验结果显示,80日龄商品蛋鸡在接种2次疫苗(0.5 mL/只)3周至16周,血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在6.8 log2以上;2周龄鸭接种2次疫苗(0.5 mL/只),在首次免疫后3周至14周,血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在6 log2以上。上述结果首次表明,禽流感杆状病毒载体三价灭活疫苗具有良好的免疫效力,能够预防H5亚型和H7亚型禽流感(AI),商品蛋鸡和鸭按照免疫程序接种2次疫苗后能够产生持久的HI抗体。本研究为禽流感疫苗的研制提供了新思路和科学依据。

2株H7N9亚型重组禽流感病毒的生物学特性和免疫原性研究

为评估经反向遗传构建的H7N9亚型重组禽流感病毒(AIV)H7-Re1株和H7-Re2株的生物学特性及免疫原性,本研究将这2株病毒分别以10^4倍稀释接种10日龄SPF鸡胚后,36℃培养,观察鸡胚存活情况并检测病毒HA效价,结果显示96 h时,2株病毒接种的鸡胚全部存活,培养至72 h时其HA效价均为9 log2,均显著高于亲本分离株。测定2株病毒的静脉内接种致病指数(IVPI),结果显示均为0。将2株病毒分别以10^6 EID50剂量鼻腔内接种5周龄SPF鸡,进行致病性试验,结果显示,接种后14 d内,2株病毒接种鸡均无临床症状,也不排毒。以2株病毒为种毒分别制备油乳剂灭活疫苗,以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡后3周时检测免疫鸡血清中HI抗体,结果显示,两种疫苗免疫鸡平均HI效价均可达到8.0 log2。于免疫后21 d,H7-Re1株免疫组鸡分别攻击10^6 EID50的H7N9亚型低致病力AIV(PG/SHH/S1069/13株)和10^5 EID50的高致病力AIV(CK/GX/SD098/17株),进行攻毒试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均全部存活,且无发病和排毒出现。H7-Re2株免疫组鸡于免疫后21 d分别以10^5 EID50的剂量进行高致病力H7N9亚型AIV(CK/GX/SD098/17株)和H7N2亚型AIV(DK/FJ/SE0195/18株)的攻毒保护试验,结果显示两种病毒攻毒后免疫鸡均不发病、不死亡、不排毒。以上结果表明,以H1N1亚型A/Puerto Rico/8/34株病毒为内部基因供体、经反向遗传学方法构建的H7-Re1株和H7-Re2株均具有生长滴度高、生物安全性高和免疫原性好的特点。本研究为H7N9亚型禽流感疫苗的研制和应用奠定了基础。

细胞源禽流感病毒三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)免疫效力研究

为评估重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(细胞源,H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)的免疫效力及对近期分离的H5和H7禽流感病毒(AIV)的免疫保护效果,本研究将3批疫苗以0.3 mL/只接种3周龄SPF鸡,疫苗接种后3周采集血清,检测针对H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re3株AIV的HI抗体效价;免疫后3周,以鼻腔感染的方式分别感染效力检验毒株和近期监测到的H5N1、H5N6和H7亚型AIV,进行攻毒效力试验。结果显示,3批疫苗接种SPF鸡3周时,血清中针对Re-11株、Re-12株和H7-Re3株抗原的平均HI抗体效价均在7.7log2~8.3log2,对照组鸡血清HI抗体均为阴性;分别以100 CLD50攻击H5亚型2.3.4.4h分支、2.3.2.1d分支AIV和H7N9亚型AIV效力检验毒株后14 d内,对照组鸡全部发病死亡且排毒,3批次疫苗免疫组鸡均不发病、不排毒、不死亡,获得完全保护。对近期分离H5和H7亚型AIV的免疫保护效力试验结果显示,接种0.3 mL/只疫苗3周的SPF鸡血清中针对3种抗原的平均HI抗体效价均在8log2左右。分别以105EID50攻击2019年分离的1株H5N6亚型、1株H5N1分离株、2株H7N9亚型AIV及2018年分离的H7N2亚型AIV后14 d内,对照组SPF鸡全部发病死亡,所有免疫组鸡均获得100%免疫保护。以上结果表明,细胞源重组AIV(H5+H7)三价灭活疫苗具有良好的免疫原性,能够完全抵御近期监测到的H7N9亚型AIV及H5N1和H5N6亚型AIV的攻击。本研究为细胞源AIV(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株、H7N9 H7-Re3株)的研发和应用提供了依据。

现用重组AIV(H5+H7)三价灭活疫苗对近期H5和H7亚型AIV分离株的免疫效力研究

为评估现用重组禽流感病毒(AIV)(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+Re-12株,H7N9 H7-Re3株)对我国近期H5和H7亚型AIV分离株的免疫预防效果,本研究对60只3周龄SPF鸡以肌肉注射途径接种该疫苗(0.3 mL/只),另外,60只鸡注射PBS作为阴性对照组;免疫3周后分组,每10只免疫鸡和10只对照鸡为一组,共6组,采集各组鸡血清并检测针对6株AIV分离株(2020年~2021年分离的4株H5N6、1株H5N8和1株H7N9亚型AIV)的相应HI抗体效价。同时用上述6株AIV分离株作为抗原差异代表株,分别以105EID50的剂量进行攻毒试验,攻毒后5 d采集各组所有存活鸡的喉头和泄殖腔拭子样品,死亡鸡样品随时采集,进行排毒检测。HI抗体检测结果显示,免疫后3周,5组免疫鸡血清中针对H5亚型Re-11株和Re-12株抗原的HI抗体效价在8log2~8.6log2,针对4株H5N6 AIV分离株(DK/HuN/S11553/2020、 DK/GD/SC001/2020、 DK/FJ/S1424/20和GS/GZ/S1569/21)和1株H5N8 AIV分离株(WS/SX/4-1/20)的平均抗体效价分别为5.0log2、4.6 log2、4.3log2、3.8 log2、3.7log2;针对H7N9 AIV H7-Re3株的HI抗体效价为7.8log2,而针对H7N9 AIV分离株CK/YN/SD024/21的平均抗体效价为4.0log2;对照组鸡血清中针对疫苗株和所有分离株的HI抗体均为阴性。表明上述分离株与现用疫苗株存在较大抗原性差异。攻毒后14 d的观察期内,所有免疫组鸡均健活,且攻击3株H5N6和1株H7N9 AIV分离株的免疫组鸡均不排毒,但攻击1株H5N6 AIV分离株(GS/GZ/S1569/21)和H5N8 AIV分离株的免疫组分别有2/10和3/10只鸡的喉头拭子样品中检测到低水平的病毒;所有对照组鸡在攻毒后4 d内全部发病、死亡,且死亡对照组鸡的喉头和泄殖腔拭子样品均呈AIV阳性。以上结果表明,以近期野鸟或家禽中分离的H5和H7亚型AIV抗原变异株攻击各组鸡后,现用的H5+H7 AIV三价灭活疫苗可对免疫鸡提供无临床发病的保护,并可有效阻止分离株在鸡体内的复制。本研究为H5和H7三价疫苗的应用及更新提供了科学依据。