1株大黄鱼源肺炎克雷伯菌的分离鉴定与致病性分析

近年来由肺炎克雷伯菌感染水产动物引发的病害频繁发生,严重阻碍了水产养殖业的健康发展。采用细菌分离培养和形态学观察手段自人工饲养发病的大黄鱼肝脏内分离到1株疑似致病菌KPLYC2,并进行鉴定,通过回归感染试验发现,分离株KPLYC2可引起与自然发病大黄鱼相似的症状及致其死亡,分离株KPLYC2对大黄鱼的半数致死密度为6.8×10^(6)cfu/mL,而且可引起大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏发生明显组织病理性损伤。分离株KPLYC2还可感染小鼠引发全身多系统性病理损伤。经过生理生化特征检测及16S rRNA序列分析和构建进化树发现,分离株KPLYC2与肺炎克雷伯菌的基因相似度超过99%,因此将分离株KPLYC2鉴定为肺炎克雷伯菌。药敏试验结果显示,肺炎克雷伯菌KPLYC2对氨苄西林、青霉素G和四环素等不敏感。笔者首次自大黄鱼体内分离出1株肺炎克雷伯菌并研究其致病性和耐药性,获得的数据将对该病的防控提供参考和依据。

肺炎克雷伯菌外膜磷酸孔蛋白PhoE的生物信息学和免疫原性分析

为了探究肺炎克雷伯菌外膜磷酸孔蛋白(PhoE)的生物信息学特征和免疫原性,本试验通过在线服务器MultAlin分析不同肺炎克雷伯菌参考株的PhoE氨基酸序列保守性;通过ProtParam和SOMPA分析该蛋白的理化性质和二级结构;通过SWISS-MODEL进行PhoE同源建模;利用IEDB、DNASTAR软件预测该蛋白的优势B细胞抗原表位;通过质粒构建、重组蛋白表达和纯化获得PhoE重组蛋白,免疫接种小鼠后,应用Western blot和ELISA评价其免疫原性。氨基酸序列分析结果显示,PhoE是一种保守性较强的稳定亲水性蛋白质,其主要位于菌体外膜中;PhoE包含的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构成占比较大;并且其可形成三聚体的稳定桶形结构。经软件预测和筛选,PhoE具有7个优势性B细胞抗原表位,分别是Y^(43)FSDYDSKDGDQT^(55)、F^(81)SGNKTESDSSQK^(93)、Q^(172)GKNEGREAKKQNGD^(186)、S^(210)DRTNDQNLLARGQGSKAE^(228)、E^(249)TRKMTPISGGFANKA^(264)、K^(289)GKDIEGVGSEDL^(301)和I^(325)NQLKSDNKLGINDD^(339)。经PCR扩增获得了肺炎克雷伯菌CVCC4080株的phoE基因,与GenBank中其他肺炎克雷伯菌参考株的序列同源性均高于99.8%,PhoE经大肠杆菌表达后主要以包涵体的形式存在。ELISA和Western blot结果显示,PhoE具备良好的免疫原性。本试验通过生物信息学方法分析了肺炎克雷伯菌PhoE的理化特性,并通过试验证实了其具有良好的免疫原性,为PhoE的生物学功能研究、血清学检测方法的建立提供了数据支持,并为亚单位和表位疫苗的研制提供参考依据。

1株大黄鱼源金黄杆菌的分离鉴定和耐药性分析

【目的】探究引发浙江省某养殖场大黄鱼发病的病原及其致病性和耐药情况。【方法】无菌条件下剖检发病大黄鱼,取其肝脏和肾脏组织,划线分离培养细菌,通过形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列分析鉴定分离菌的种属特性,通过人工感染和组织切片制备评价分离菌对大黄鱼的致病性,最后通过药敏纸片法检测分离菌的耐药性。【结果】分离菌在培养基上外观为表面凸起、光滑和边缘整齐的黄色圆形菌落;革兰氏染色后光学显微镜下呈现出单个分散或成对分布的红色短棒状杆菌;该分离菌可在麦康凯琼脂上生长,可利用葡萄糖产酸;16S rRNA基因序列相似性分析及系统进化树显示,该分离菌与金黄杆菌相似性高达97.0%以上并聚为一类。动物回归试验结果显示,分离菌可引起大黄鱼的肝脏、肾脏和脾脏发生明显病变,半数致死量为6.32×10^(4) CFU/mL,表明其对大黄鱼具有较强致病性;药敏结果显示,分离菌对阿米卡星和左氧氟沙星敏感,对庆大霉素、新霉素和红霉素中度敏感,对头孢克肟、氨苄西林、卡那霉素、呋喃唑酮等耐药。【结论】本研究分离了大黄鱼源致病株金黄杆菌,并通过其致病性和耐药性研究为金黄杆菌引发水产动物发生病害的防控和治疗提供参考。