RNA干扰的机制及其抗肝炎病毒的应用

RNA干扰现象自被发现后,已被广泛应用于基因功能、抗病毒治疗和信号转导系统方面的研究.本文对这一现象从研究历史、作用机制、抗病毒应用以及存在的问题等方面进行初步的探讨.

RNA干扰抑制HepG_2-N10细胞系中HBV基因表达及复制

目的:评估以U6启动子作为启动序列(pSilencer2.0-U6)载体介导的小RNA干扰片段在培养细胞株中抑制HBV复制的效应.方法:将针对HBV基因组不同区域(S,X及C区)的核苷酸序列插入至pSilencer载体中,并将重组后的pSilencer质粒(分别为pS,pX及pC)载体转染入HepG2-N10细胞株(可稳定表达HBsAg、HBeAg及adw2亚型Dane颗粒)中.以ELISA法检测病毒抗原,以逆转录-聚合酶链反应法(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测病毒mRNA,并以荧光定量PCR法检测分泌入培养基的共价闭合环状DNA(covalentclosedcircularDNA,cccDNA).结果:质粒载体介导的RNA干扰能明显抑制培养基中HBsAg及HBeAg的表达.并且RT-PCR法检测显示病毒mRNA也被降解了,从而减少了蛋白表达及病毒逆转录复制的模板.荧光定量PCR法检测显示分泌入培养基的cccDNAs明显下降(HBVDNAlog10:pS:4.00±0.13;pC:4.08±0.10;pX:4.28±0.06;pN:5.05±0.07;HepG2-N10:4.74±0.06;HepG2:<2.70).结论:RNA干扰能抑制HBV基因表达及病毒复制,并且RNA干扰可能为HBV的治疗带来巨大的变化.

发展以抗乙肝病毒为目的RNA干扰的思路

RNA干扰的重要作用之一就是治疗应用,如进行抗病毒治疗等．体内RNA干扰存在干扰片段稳定性差、转运效率低等不足之处．随着研究的深入,学者们对上述问题提出了各种解决方案．本文对这些解决方案进行了初步的总结．

TFF1在正常及损伤胃黏膜中的表达改变

目的:通过观察 TFF1在人消化性溃疡及阿司匹林诱导的兔胃溃疡中的表达,探讨 TFF1在胃黏膜保护中的作用.方法:采用免疫组化方法测定正常及消化性溃疡患者、正常及阿司匹林诱导的兔胃溃疡模型中胃黏膜 TFF1的表达,通过图像分析软件分析其阳性信号平均光密度值了解其表达情况.结果:(1)消化性溃疡患者胃黏膜中 TFF1的表达高于正常胃黏膜(P<0.01);其中,多发/复合性溃疡表达高于单发消化性溃疡(P<0.05).(2)阿司匹林诱导的兔胃溃疡周围黏膜TFF1表达高于正常兔胃黏膜(P<0.05).结论:TFF1于在人消化性溃疡及药物诱导的兔胃溃疡中的表达较正常升高,提示其在胃黏膜保护及上皮重建机制中具有重要的作用.

三叶因子1表达与胃粘膜损伤及胃癌的关系

目的测定三叶因子1在正常及病理条件下胃粘膜中的表达情况,探讨TFF1在胃粘膜损伤修复及胃癌抑制中的作用及意义。方法应用免疫组化方法测定正常及不同病理条件下胃粘膜中TFF1的表达情况,通过图像分析软件分析其阳性信号平均光密度值了解其表达情况。结果胃炎、胃溃疡及十二指肠球部溃疡患者TFF1表达明显高于正常胃粘膜;多发/复合性溃疡患者TFF1表达高于单发的消化性溃疡患者;胃溃疡患者与十二指肠球部溃疡患者、胃炎患者与单一消化性溃疡患者表达相比均无统计学差异;胃腺癌患者癌旁组织表达明显高于正常胃粘膜,而腺癌组织的表达强度则与癌组织的分化程度呈正比,分化程度愈低,表达愈弱,低分化腺癌无阳性表达,中、高分化腺癌表达略低于正常粘膜,但二者对比无统计学差异;食管鳞癌及癌旁组织均无阳性表达;各组男女对比均无统计学差异。结论TFF1在胃炎及消化性溃疡中表达升高,且在多发/复合性溃疡中的表达较单发溃疡表达升高,即粘膜损伤越严重其表达越强,提示其在胃粘膜保护及促进上皮重建机制中具有一定的作用。TFF1在癌旁组织中表达增强提示其可能与肿瘤抑制及分化机制有关,而在癌组织中表达减弱,且分化程度越低表达越弱可能与癌组织腺体及细胞破坏、TFF1的分泌减少有关。

酒精性胃病

酒精是引起胃黏膜损伤的重要原因之一,了解其形成原因及防治具有重要意义.酒精导致的胃黏膜损伤包括急性及慢性损伤两方面,前者主要表现为黏膜炎症,后者表现为黏膜糜烂伴上皮代偿性增生,并可能引起恶变.主要原因在于酒精可从多方面导致对胃黏膜的侵袭因素增强,同时使黏膜防卫因素相对减弱.长期以来,酒精引起的胃黏膜慢性损伤在临床上并未受到充分的重视.由于酒精导致的胃黏膜损伤是多方面的、多阶段的,可以视为一个临床症候群,因此我们提出“酒精性胃病”这一概念,以期临床上对这一症候群引起足够的重视.我们重点讨论了酒精性胃病的发病机制,同时对这一疾病的诊治进行了探讨.

三叶因子1在乙醇诱导的大鼠急性胃黏膜损伤中的表达

背景:三叶因子具有胃黏膜保护作用,但其在乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤中黏膜保护作用的研究较少。目的:观察短期灌注不同浓度乙醇大鼠胃黏膜三叶因子(TFF)1的表达情况,探讨TFF1与胃黏膜保护的相关性。方法:采用不同浓度乙醇直接灌胃制备急性胃黏膜损伤大鼠模型,以0.9%NaCl溶液灌胃作为对照,分别在肉眼和光学显微镜下观察胃黏膜形态学变化并评估黏膜损伤指数(LI),逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠胃黏膜TFF1 mRNA的表达。结果:40%、70%、100%乙醇灌胃2h后大鼠胃黏膜LI分别为38.38±6.37、70.00±8.02和118.75±14.82,显著高于对照组(P均<0.01)。在40%乙醇和70%乙醇组大鼠胃黏膜中TFF1/β-actin光密度比值分别为1.27±0.10和1.07±0.13,显著高于对照组的0.93±0.10(P均<0.01),100%乙醇组TFF1/β-actin光密度比值为0.68±0.09,显著低于对照组(P<0.01)。结论:胃黏膜损伤程度与乙醇浓度呈正相关,乙醇浓度越高,胃黏膜损伤越严重;一定程度的胃黏膜损伤TFF1 mRNA表达升高,严重胃黏膜损伤TFF1 mRNA表达反而下降。一定程度的损伤刺激能使TFF1产生胃黏膜保护作用。

胃黏膜保护的基础与临床研究进展

长期以来胃黏膜保护一直是基础和临床研究的重点与热点.近年来人们对胃黏膜保护的细胞和分子机制已有了全面深入的认识,发现具有胃黏膜细胞保护作用的物质有很多种,具有细胞保护作用的器官和组织也不仅仅限于胃黏膜,在胰腺、肝脏、肾脏、心脏和脑等都发现有类似现象.因此细胞保护概念的内涵和外延都有拓展.我们对三叶因子、氧自由基、幽门螺杆菌、酒精、非甾体类抗炎药及细胞因子等研究热点与胃黏膜保护相互作用的机制进行初步的探讨.

AMP-18,一种新发现的胃黏膜保护因子

AMP-18是一种新发现的由胃腺体上皮细胞合成的小分子蛋白质,独特表达于胃黏膜,机体其他部位少见,胃癌组织中表达缺失．AMP-18 由185个氨基酸组成,除去N端信号肽(20个氨基酸)后大小约18 ku,第54-150个氨基酸组成高度保守的结构域(BRICHOS区域)承担主要的生理功能．AMP-18由胃腺体上皮细胞以胞吐的方式分泌到胃黏液中,他的合成和分泌与个体生长发育有关,并受福斯高林、吲哚美辛、地塞米松等药物的影响．目前发现 AMP-18的生理功能主要有促进胃黏膜上皮细胞的有丝分裂,促进细胞的迁徙,促胃肠黏膜损伤的修复,保持胃肠黏膜的完整等．

三叶因子与胃黏膜保护的研究进展

三叶因子家族是一群主要由胃肠道黏液细胞分泌的小分子多肽.其共同特征为均含一特殊的P结构域及三叶状结构.这种稳定的结构使三叶因子家族具有明显的抗蛋白酶水解、酸消化及耐热特性,因而能在消化道复杂的环境中保持生物活性.目前在哺乳动物体内发现的有pS2/TFF1、SP/TFF2和ITF/TFF3三种,它们具有黏膜保护与修复、肿瘤抑制、信号传导、调节细胞凋亡等功能.本文阐述了三叶因子家族发现的历史,并初步探讨了其作用.同时也对三叶因子受体这一热点的研究现状进行总结.

托伐普坦对肝硬化腹水并发低钠血症患者Na^+调控作用的影响

目的观察托伐普坦对肝硬化腹水并发低钠血症患者Na^+的调控作用。方法选取2013年1月~2016年1月厦门大学附属第一医院收治的肝硬化腹水并发低钠血症患者110例。随机分成2组,A组55例使用托伐普坦治疗,不限液体入量,限制体内钠盐摄入;B组55例使用常规治疗,控制其每天液体摄入量在1~1.5 L,并视每位患者的具体情况而定适时补充钠盐和白蛋白以及利用利尿剂。治疗周期为8 d,比较2患者治疗前后体内的血钠值、血钾浓度和尿量,记录2组患者在治疗过程中的不良反应。结果治疗后第8天,A、B组患者血钠值均显著高于治疗前(P<0.05);A、B组患者尿量分别为(3 124.2±689.2)ml和(1 722.3±625.7)ml,与治疗前(1 253.6±504.4)ml和(1 277.5±647.3)ml相比,差异有统计学(P<0.05)。且A组患者治疗过程中伴有口干、渴感等不良反应,B组患者不良反应不明显。结论托伐普坦对肝硬化腹水并发低钠血症患者的Na^+有明显调控作用,和常规治疗方式相比作用显著。

胃黏膜保护的基础与临床研究——三叶因子与胃黏膜保护的研究进展

三叶因子家族是一群主要由胃肠道黏液细胞分泌的小分子多肽．其共同特征为均含一特殊的P结构域及三叶状结构．这种稳定的结构使三叶因子家族具有明显的抗蛋白酶水解、酸消化及耐热特性，因而能在消化道复杂的环境中保持生物活性．目前在哺乳动物体内发现的有pS2/TFF1、SP/TFF2和ITF/TFF3三种，它们具有黏膜保护与修复、肿瘤抑制、信号传导、调节细胞凋亡等功能．本文阐述了三叶因子家族发现的历史，并初步探讨了其作用．同时也对三叶因子受体这一热点的研究现状进行总结．

FHIT基因蛋白表达与结直肠癌及癌前期病变的临床关系

目的:探讨脆性组氨酸三联体(fragile histidine trail,FHIT) 蛋白在45例结直肠癌、36例结直肠腺瘤和23例正常对照组中的表达睛况. 方法:标本经40 g/L甲醛固定,常规石蜡包埋,采用免疫组化SP法检测FHIT在结直肠癌、结直肠腺瘤和正常对照组中的表达. 结果:在45例结直肠癌中28例FHIT蛋白表达显著减少或缺失,5例表达减弱,12例表达阳性;其中结直肠癌Dukes A,B和C期FHIT蛋白表达阴性比例分别为6/11,5/12 和17/22.在36例结直肠腺瘤中7例FHIT蛋白表达显著减少或缺失,4例表达减弱,25例表达阳性;其中结直肠腺瘤伴轻、中和重度不典型增生FHIT蛋白表达阴性比例分别为2/16,1/7和4/13.FHIT蛋白阴性表达在结直肠癌和正常对照组(62.2% vs 4.4%,X2=25.33,P<0.01)、结直肠癌和结直肠腺瘤(62.2% vs 19.4%,X2=14.19,P<0.01)、结直肠癌未伴淋巴转移的Dukes A+B期和已伴淋巴转移的C 期(47.8% vs 77.3%,X2=4.28,P<0.05)间均有显著性差异,而在结直肠腺瘤伴轻度不典型增生和中、重度不典型增生(12.5% vs 25.0%,X2=0.84,P>0.25),结直肠腺瘤和正常对照组(19.4% vs 4.4%,X2=3.51,P>0.05)中无显著性差异. 结论:FHIT蛋白在结直肠癌中呈低表达或缺失,且FHIT低表达与转移状况有相关关系,提示该基因可能与结直肠癌的发生发展有关.

乙型肝炎病毒全S蛋白与纤维蛋白原α链的相互作用

目的:筛选人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎病毒(HBV)全S蛋白相互作用蛋白的基因,并反向验证HBV全S蛋白候选结合蛋白之间相互作用.方法:将全S基因定向克隆到酵母表达载体pDEST32,构建正向筛选的诱饵质粒并Westernblot法验证其在酵母中的表达.将诱饵质粒与人肝细胞cDNA文库质粒共同转化MaV203酵母细胞,在人肝细胞cDNA文库筛选候选结合蛋白,提取阳性菌落质粒测序,并分析其生物学性质.将筛选出的纤维蛋白原α链中下游序列及不同全S变异株基因,分别定向克隆到pDEST32及pDEST22载体中,利用Westernblot法验证表达.将诱饵质粒与猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,以反向酵母双杂交方法验证初筛结果的可靠性及正确性.结果:正向的酵母双杂交实验,经初筛和再转染实验纤维蛋白原α链可与HBV全S蛋白发生相互作用.再以纤维蛋白原α链为靶基因设计诱饵质粒,以四种变异的HBV全S蛋白为靶基因设计猎物质粒,反向酵母双杂交法证实维蛋白原α链中下游可与不同全S变异体(总差异率2%)发生相互作用,纤维蛋白原α链与全S蛋白的结合域可能为病毒蛋白的前268aa.结论:纤维蛋白原α链中下游可与HBV全S蛋白产生特异性结合,其结合域可能与病毒蛋白的前268aa产生相互作用.

福辛普利和氨氯地平对高血压病患者血压和肾功能的影响

目的 :探讨福辛普利和氨氯地平对高血压病患者血压和肾功能的影响。方法 :40例高血压病患者随机被分成2组 :福辛普利组 (2 0例 ,10 mg,1次 /日 ) ,氨氯地平组 (2 0例 ,5 m g,1次 /日 ) ;疗程 2 4周 ,治疗前、后观察血压和肾功能变化。结果 :(1)两组患者治疗后动脉压及尿蛋白的排泄量均显著降低 ;(2 )福辛普利组尚能显著提高肾小球滤过率 (P<0 .0 5 )。结论 :福辛普利和氨氯地平均能有效降低高血压病患者的血压及尿蛋白排泄量 ;福辛普利还有保护肾功能的作用。

药物性肝损伤患者临床特征分析

背景:药物性肝损伤(DILI)是一类临床常见疾病,临床表现不典型,易误诊、漏诊。目的:探讨DILI患者的临床特征。方法:收集厦门大学附属中山医院2014年1月—2015年12月收治并确诊的DILI患者的临床资料,回顾性分析其临床特征,并探讨临床特征与预后的相关性。结果:共纳入DILI患者51例,男女比例为1∶1.32,平均年龄(50.6±17.9)岁,其中60岁及以上人群占比最高(43.1%)。肝细胞损伤型为主要肝损伤类型(84.3%)。引起DILI最常见的药物依次为中草药、心血管系统药以及激素和内分泌代谢药,分别占51.0%、19.6%和9.8%。患者合并的基础疾病涵盖全身多个系统。DILI临床表现不典型,实验室检查亦缺乏特异性,5.9%的患者自身抗体阳性。大部分DILI患者预后较好,治愈率和好转率分别为21.6%和66.7%,死亡率为5.9%,死因均为肝衰竭。患者入院时丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)、白蛋白水平和凝血酶原时间(PT)、凝血酶原时间国际标准化比值(INR)与预后显著相关(P<0.05)。结论:DILI好发于老年人群,中草药的不规范使用可能是导致其发生的重要因素。DILI临床表现不典型,大部分患者预后较好。入院时ALT、AST、TBIL、白蛋白水平和PT、INR与预后密切相关。

抗血小板聚集药物对上消化道出血患者的临床病症及影响因素分析

目的抗血小板聚集药物对上消化道出血患者临床病症及影响因素分析。方法采用回顾性分析的研究方法,收集2012年6月-2015年6月入厦门大学附属第一医院治疗消化道出血的110例患者资料,分为2组,对照组79例未服用抗血小板聚集药物治疗,实验组31例服用单一抗血小板聚集药物治疗,观察2组患者的消化道出血程度、出血方式,以及在内镜下表现的特征,参照每位患者的年龄、INR值,服用的药物类型,进一步分析该类药物对上消化道出血患者的临床病症和影响因素。结果实验组消化道出血严重率明显高于对照组（P〈0.05）,患者年龄越大,消化道出血率越高,在内镜下主要表现为胃炎或溃疡,INR〉3的患者消化道出血严重率明显高于INR〈3的患者。结论抗血小板聚集药物会明显增加消化道严重出血的机率,患者年龄及药物种类均能影响消化道出血的发生率;长期使用该类药物对十二指肠的影响最为严重,可导致该部位肠粘膜受损;随患者年龄增大,患者消化道的不良反应增大。

三叶因子2相互作用蛋白基因在胃癌细胞cDNA文库中的筛选

目的:筛选并克隆人胃癌细胞cDNA文库中与三叶因子2(trefoil factor family2,TFF2)蛋白相互作用的蛋白基因.方法:RT-PCR方法验证胃癌细胞存在TFF2mRNA表达;PCR法扩增TFF2基因,NotⅠ与SalⅠ双酶切后定向克隆到酵母表达载体pDEST32,构建TFF2的诱饵质粒;Western blot验证TFF2诱饵质粒在酵母细胞中相应融合蛋白的表达;将诱饵质粒和人胃癌-cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母感受态细胞,通过营养缺陷型培养基(Ura、His)与X-gal进行3重筛选阳性克隆,提取阳性克隆质粒测序,应用蛋白质数据库及生物信息学技术,对测序结果进行分析.结果:RT-PCR法证实胃癌细胞中存在TFF2mRNA表达;构建pDEST32-TFF2诱饵表达质粒成功;Western blot法证实诱饵质粒转化酵母细胞后正确表达TFF2-GAL4DBD融合蛋白;通过酵母双杂交筛选胃癌细胞cDNA文库共获得35个表达His、Ura及X-gal报告基因的阳性克隆,其中测序成功为16个克隆,包含12个已知蛋白基因与4个未知功能基因.结论:从胃癌细胞cDNA文库中筛选出多种TFF2相互作用蛋白基因,其可能与胃癌的发生发展密切相关.

一种新的乙型肝炎病毒X基因变异方式

目的:证实乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)X基因一种新的变异方式.方法:从HBV慢性感染患者血清中提取HBVDNA,扩增X基因序列,克隆入pMD19T载体,选择阳性克隆进行DNA测序,与已知HBV基因相应序列比较该患者体内HBV基因变异位点以及变异形式.结果:从21例患者中共挑选74个克隆测序,测序结果提示54个克隆X基因下游大段缺失突变,长度达234nt,位于1601-1834nt处,另有1个克隆发生245nt缺失突变.发生缺失变异的病毒株同时存在G/A1515C、G1518C和A1585T替换突变,这两种突变具有联动特征.缺失突变株HBx仅编码76aa,其第44和45位编码为LL,具有特异性.结论:观察到一种X蛋白变异方式,这种大段缺失突变导致X蛋白下游编码序列丢失,其为X因子还是X蛋白以及这种变异是否为常态形式尚需进一步研究.

乙型肝炎病毒前-X融合蛋白结合蛋白的筛选

目的利用酵母双杂交技术自肝细胞cDNA文库中筛选HBV前-X(pre-X)融合蛋白结合蛋白,探讨pre-X融合蛋白的生物学功能。方法 PCR扩增HBV pre-X基因序列,根据酵母双杂合体系构建诱饵质粒pDEST32-pre-X,并测定DNA序列验证。将质粒pDEST32-pre-X转化为酵母细胞MaV203,应用Western blot验证pre-X融合蛋白在酵母细胞中正确表达,再与转化为人肝细胞cDNA文库质粒的酵母细胞pDEST22配合,在营养缺陷型培养基和X-gal上三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的猎物质粒进行DNA测序。利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对筛选结果进行分析。结果成功构建pDEST32-pre-X诱饵质粒,Western blot证实转化诱饵质粒的酵母细胞能正确表达pre-X融合蛋白,pDEST32-pre-X及正常成人肝细胞cDNA文库共转化酵母细胞后,选择性培养出45个菌落,经缺陷培养基分离及X-gal检测后筛选出3个阳性克隆,测序结果为一种蛋白,即TCP1蛋白。结论用酵母双杂交技术筛选出1个与pre-X融合蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白,为进一步研究HBV pre-X融合蛋白的作用提供了新线索。