牙龈卟啉单胞菌通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进食管鳞癌自噬

目的探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)促进食管鳞癌(ESCC)细胞自噬发生的分子机制。方法Pg感染siAtg7或氯喹(CQ)预处理的KYSE70细胞和KYSE140细胞,Western blot检测Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白,荧光共聚焦显微镜检测mRFP-GFP-LC3标记ESCC细胞自噬流,CCK-8法检测ESCC细胞活性,迁移小室检测ESCC细胞迁移及侵袭能力。miR-21-5p inhibitor、RASA1过表达或U0126分别阻断miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路,如上检测自噬相关表型变化。免疫组化检测ESCC组织中Pg丰度和LC3蛋白表达,RT-PCR检测ESCC及其癌旁组织中miR-21-5p的表达,统计分析Pg、LC3和miR-21-5p相关性。结果Pg感染诱导KYSE70细胞和KYSE140细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达上调、p62蛋白表达下调,增加了mRFP-GFP-LC3标记细胞中的红色、绿色和黄色荧光斑点数目和荧光强度,同时促进KYSE70细胞和KYSE140细胞增殖、迁移和侵袭能力增加,上述Pg诱导的ESCC细胞表型改变被CQ或siAtg7预处理逆转。miR-21-5p inhibitor、U0126或RASA1过表达质粒的预处理,也同样逆转了Pg对ESCC细胞自噬的促进作用。Pg丰度与miR-21-5p、LC3蛋白表达呈正相关。结论Pg通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进ESCC自噬发生。

食管鳞癌中牙龈卟啉单胞菌通过14-3-3σ调控程序性死亡-配体1蛋白降解

牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是口腔疾病的重要致病菌之一,与人食管鳞癌(ESCC)进展密切相关。然而P.gingivalis促进ESCC发生发展的分子机制尚不十分清楚。该研究探讨了ESCC中P.gingivalis通过诱导程序性死亡-配体1(PD-L1)蛋白表达上调的分子机制。Western印迹和RT-PCR结果显示,KYSE140和KYSE150细胞中14-3-3σ与PD-L1的蛋白质表达呈负相关,但二者的mRNA表达无相关性。免疫共沉淀结果表明,14-3-3σ蛋白通过与PD-L1蛋白结合,促进PD-L1的泛素化降解,P.gingivalis感染干预了14-3-3σ与PD-L1蛋白质复合体形成;KYSE140和KYSE150细胞中14-3-3σ沉默,降低了PD-L1泛素化介导的蛋白质酶体降解,14-3-3σ过表达明显抑制P.gingivalis诱导的PD-L1蛋白表达上调。免疫组化结果进一步证实,在ESCC组织中P.gingivalis丰度与14-3-3σ蛋白表达呈负相关,与PD-L1蛋白表达呈正相关,14-3-3σ与PD-L1的蛋白质表达呈负相关。综上所述,ESCC中P.gingivalis通过下调14-3-3σ蛋白表达,降低14-3-3σ介导的PD-L1蛋白的泛素-蛋白质酶体降解途径,进而抑制抗肿瘤免疫,促进ESCC恶性演进。

口腔健康状况与食管鳞癌发病风险的研究进展

食管癌(esophageal cancer,EC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,进展迅速及预后不良。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)约占EC的90%以上,存在明显的地域、性别及年龄等差异。目前大量研究显示口腔卫生不良是ESCC发病的危险因素之一,但是口腔卫生不良与多种因素相关,且混杂因素较多,因此本综述从牙齿缺失、牙周炎及口腔微生态三方面总结这些因素与ESCC之间的关系,为ESCC高危人群筛查、预防提供新靶标。

甲醛固定石蜡包埋食管鳞状细胞癌组织蛋白提取方法的比较

目的探讨从甲醛固定石蜡包埋(FFPE)食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中高效率提取蛋白质的方法。方法6种裂解液和100℃、105℃两种条件分别提取8例甲醛固定石蜡包埋食管鳞状细胞癌组织蛋白,Bradford法测定蛋白浓度、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blotting和免疫组织化学评价各方法提取组织蛋白的效率和质量,不同蛋白沉淀方法纯化提取蛋白。结果Laemmli裂解液(4号)100℃处理提取癌组织蛋白效率最高,Western blotting检测癌组织中14-3-3σ蛋白表达与免疫组织化学检测结果一致;2倍体积乙腈(含0.1%三氟乙酸)沉淀FFPE提取蛋白能够降低蛋白电泳背景。结论Laemmli裂解液100℃处理可高效提取的甲醛固定石蜡包埋组织蛋白且适用于Western blotting检测蛋白标志物分子,乙腈蛋白沉淀法能够进一步去除残余的交联蛋白质分子。

牙龈卟啉单胞菌通过上调S100A2促进食管鳞癌的侵袭性

目的探讨牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)通过调控S100A2表达促进食管鳞癌(ESCC)的侵袭性。方法Western blot方法检测P.gingivalis(MOI 10)感染ESCC细胞系KYSE70细胞后S100A2蛋白水平的表达;siS100A2沉默KYSE70细胞中S100A2表达,检测P.gingivalis感染KYSE70及对照细胞增殖(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)、迁移、侵袭(迁移、侵袭小室)能力;免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)检测47例ESCC手术标本中S100A2表达,并分析其与P.gingivalis相关性。结果P.gingivalis能诱导ESCC细胞中S100A2蛋白表达上调;S100A2沉默能够抑制P.gingivalis诱导的ESCC细胞增殖、迁移、侵袭能力的增加;ESCC中S100A2表达与P.gingivalis丰度富集呈正相关。结论P.gingivalis可能通过上调S100A2表达促进ESCC侵袭性,S100A2可能是ESCC临床靶向治疗新分子。

食管鳞癌多药耐药细胞建立及干性和上皮间质转化表型鉴定

目的建立人食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)多药耐药细胞株,探讨ESCC化疗耐药的分子机制。方法采用间歇性反复冲击法筛选建立对紫杉醇(paclitaxel,PTX)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和顺铂(cisplatin,CDDP)、阿霉素(doxorubicin,DOX)和长春新碱(vincristine,VCR)等药物具有抗性的多药耐药细胞株EC9706/PDFC,测定EC9706/PDFC耐药指数(resistance index,RI)、增殖和侵袭能力、细胞周期、干性、上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)等表型变化,分析ABCB1、ABCC1、ABCC2和ABCG2在EC9706/PDFC、EC9706/CDDP和EC9706/PTX中的mRNA表达。结果EC9706/PDFC对PTX、5-Fu、CDDP、DOX、VCR等药物的RI分别为25.8、16.85、15.2、16.85和7.27。与亲本细胞EC9706相比,EC9706/PDFC细胞呈多形性、排列松散,增殖减慢,S期细胞数明显减少,侵袭和干性成球能力增加,干性和EMT相关分子表达异常。ABCB1和ABCC1在3种不同的耐药细胞中表达升高,而ABCG2表达却降低,ABCC2升高不明显。结论ESCC多药耐药细胞获得了CSC和EMT表型,为ESCC多药耐药临床评估和耐药逆转提供了细胞模型和潜在靶向分子。

牙龈卟啉单胞菌促进4NQO诱导C57BL/6鼠食管鳞癌发生

目的明确4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide,4NQO)诱导C57BL/6鼠食管鳞癌模型中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)对食管鳞癌发生的促进作用。方法120只C57BL/6鼠随机分为对照组、1,2-丙二醇溶剂对照组、4NQO组和4NQO联合P.gingivalis牙周炎组,每组各30只。4NQO诱导食管鳞癌模型中,50μg·mL^-1的4NQO处理8周后,鼠口腔上颌第二磨牙丝线结扎、P.gingivalis口腔持续感染。结果22周时,4NQO组和4NQO联合P.gingivalis组鼠食管黏膜上皮开始发生病变,肉眼观为黏膜表面粗糙,灶性颗粒状或乳头状增生;镜下为食管黏膜基底细胞增生,26周时4NQO联合P.gingivalis组出现不典型增生,36周实验终止时联合组出现癌变。与4NQO单纯处理组比较,P.gingivalis感染组小鼠食管黏膜病变面积明显增大,基底细胞增生和不典型增生发生时间提前。结论P.gingivalis能够促进4NQO诱导C57BL/6鼠食管鳞癌的发生。

鉴定肝细胞癌特异性血清细胞因子

目的鉴定肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)特异性血清细胞因子。方法用细胞因子抗体芯片检测非癌对照和HCC患者血清细胞因子,富集分析KEGG生物学通路,ProteoMap分析生物学功能构成。构建基于STRING数据库差异表达细胞因子间相互作用网络,计算节点分子的“degree”和“betweenness”,确定关键细胞因子并应用ELISA进行验证。结果鉴定出差异倍数>1.5倍的HCC相关差异表达细胞因子为43个(高、低表达分别为26个和17个),80%差异表达的细胞因子参与多个功能相关的生物学通路和信号通路。这些差异表达细胞因子构成的蛋白-蛋白互作网络中,“degree”和“betweenness”分值位居前5的细胞因子包括VEGFA、VCAM1、CXCR4、CCR7和TLR3。HCC血清中VEGFA、CCR7和CXCR4表达显著高于肝硬化和慢性乙肝患者及健康对照,其中慢性乙肝患者血清VEGFA表达高于肝硬化和健康对照,慢性乙肝和肝硬化患者血清中CCR7和CXCR4表达差异无统计学意义,但明显高于健康对照。结论VEGFA、CCR7和CXCR4是潜在的HCC血清标志物。

牙龈卟啉单胞菌促进模型鼠口腔鳞癌发展

目的探讨口腔牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)感染在4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide,4-NQO)诱导C57BL/6鼠口腔鳞癌发生发展过程中的促进作用。方法24只C57BL/6鼠随机分为对照组、P.gingivalis牙周炎组、4-NQO组和4-NQO联合P.gingivalis牙周炎组,每组6只。通过饮水喂饲各组鼠抗生素2周后,4-NQO组和联合组鼠给予4-NQO(50μg·mL-1)处理8周,鼠口腔上颌第二磨牙丝线结扎,每周2次P.gingivalis口腔涂抹感染至实验结束。结果第30周,4-NQO组和4-NQO联合P.gingivalis组鼠舌黏膜异常,肉眼观为乳头状或菜花样增生;镜下为4-NQO组出现不典型增生,4-NQO联合P.gingivalis组出现癌变。与4-NQO单纯处理组比较,联合P.gingivalis感染组小鼠食舌黏膜病变程度较重。结论P.gingivalis能够促进4-NQO诱导C57BL/6鼠口腔鳞癌的发生发展。

牙龈卟啉单胞菌诱发炎症微环境促进食管鳞状细胞癌发生

目的探讨牙龈卟啉单胞菌诱发食管炎症微环境在小鼠食管鳞状细胞癌发生过程中的作用。方法采用数字表法随机将180只C57BL/6小鼠分为对照组、牙龈卟啉单胞菌组、4-硝基喹啉-1-氧化物(4NQO)组、4NQO+牙龈卟啉单胞菌组、4NQO+牙龈卟啉单胞菌+塞来昔布组和4NQO+牙龈卟啉单胞菌+抗生素(甲硝唑、新霉素、氨苄青霉素和万古霉素,ABC)组,每组30只。给予ABC饮水2周,之后8周,对照组和牙龈卟啉单胞菌组小鼠饮用纯水,其余4组给予含30μg/ml 4NQO的饮水。第11~12周,牙龈卟啉单胞菌组、4NQO+牙龈卟啉单胞菌组、4NQO+牙龈卟啉单胞菌+塞来昔布组和4NQO+牙龈卟啉单胞菌+ABC组小鼠行上颌第2磨牙结扎;第11~34周,每周3次口腔感染牙龈卟啉单胞菌。第13~34周,4NQO+牙龈卟啉单胞菌+塞来昔布组和4NQO+牙龈卟啉单胞菌+ABC组小鼠分别接受塞来昔布和ABC处理。34周后处死小鼠,观察小鼠食管黏膜大体和形态学变化,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和免疫组化检测小鼠食管组织中炎症和肿瘤相关分子表达。结果34周时,4NQO单独处理未能显著增加小鼠食管黏膜乳头状增生病灶数、病变面积和食管壁厚度,单纯性增生病灶数(中位数为1.00个,P<0.05)和轻、中度不典型增生病灶数(中位数为2.00个,P<0.01)显著增加,小鼠食管组织中白细胞介素6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、c-myc mRNA的表达量[分别为8.35(3.45,8.99)、6.90(2.01,9.72)、12.04(3.31,14.08)、2.21(1.80,3.04),均P<0.05]和磷酸化信号转导和转录激活因子3(pSTAT3)、Ki-67、磷酸化组蛋白2A变异体(pH2AX)蛋白的表达明显高于对照组。4NQO+牙龈卟啉单胞菌组小鼠食管黏膜病变显著,乳头状增生病灶数(中位数为2.00个)、病变面积(中位数为2.51 mm^(2))和食管壁厚度(中位数为172.52μm)最大,且均与对照组差异有统计学意义(均P<0.01),单纯性增生病灶数(中位数为1.00个,P<0.05)和轻、中度不典型增生病灶数(中位数为1.00个,P<0.01)显著增加,小鼠食管组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、γ-干扰素(IFN-γ)、c-myc、cyclin D1 mRNA的表达量[分别为12.27(5.35,22.08)、13.89(10.04,15.96)、19.56(6.07,20.36)、11.37(8.23,20.07)、2.62(1.51,4.25)和4.52(2.68,7.83),P<0.05或P<0.01]和pSTAT3、环氧合酶2(COX-2)、Ki-67、pH2AX蛋白的表达均高于对照组。塞来昔布干预明显减少了4NQO联合牙龈卟啉单胞菌引起的黏膜病变面积(4NQO+牙龈卟啉单胞菌+塞来昔布组中位数为1.84 mm^(2),P<0.05)和浸润癌病灶数(4NQO+牙龈卟啉单胞菌+塞来昔布组中位数为0.00个,P<0.01),降低了pSTAT3和pH2AX的表达。ABC干预明显减少了4NQO联合牙龈卟啉单胞菌所诱导的乳头状增生病灶数(4NQO+牙龈卟啉单胞菌+ABC组中位数为1.00个,P<0.05)和浸润癌病灶数(4NQO+牙龈卟啉单胞菌+ABC组中位数为0.00个,P<0.01),降低了pSTAT3的表达,但对pH2AX的表达无明显影响。结论在4NQO诱导的基因组损伤基础上,牙龈卟啉单胞菌能通过诱发炎症微环境促进食管鳞状细胞癌的发生,使用COX-2抑制剂或ABC可以通过阻断IL-6/STAT3信号通路,减轻食管组织的炎症反应,抑制食管鳞状细胞癌的发生。

鬼针草水煎液对高脂高糖诱导的小鼠非酒精性脂肪肝的作用及机制研究

该研究旨在探讨鬼针草水煎液对高脂高糖诱导的小鼠非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的作用及相关作用机制。Balb/c小鼠随机分为正常组、模型组、二甲双胍(200 mg·kg^-1)组、鬼针草水煎液(10 g·kg^-1)组和二甲双胍(100 mg·kg^-1)+鬼针草水煎液(5 g·kg^-1)联合组。除正常组外,其他4组给予高脂高糖饲料8周,建立非酒精性脂肪肝模型,随后治疗4周,眼球取血,处死取材,检测相关指标。结果显示,与模型组相比,各给药组血脂血糖水平均明显降低(P<0.05);HE染色结果表明各给药组的肝组织病理损伤显著改善;油红O染色结果显示各给药组脂肪分布显著减少(P<0.01);免疫组织化学染色结果显示各给药组的肝组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)蛋白表达量明显降低(P<0.01);Western blot结果显示给药组内质网应激信号通路相关因子GRP78、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、上调激活转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(Chop)、肌醇需求因子1α(IRE1α)和剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸氨基转移酶(cleaved-caspase-12)的蛋白表达水平明显降低(P<0.01);联合组结果优于单独给药组。该研究表明鬼针草水煎液对高脂高糖所致小鼠非酒精性脂肪肝具有显著的治疗作用,其机制可能与下调内质网应激相关因子的表达,减轻内质网应激所致肝细胞凋亡,下调血脂血糖水平有关。

慢性牙周炎口腔变黑普雷沃氏菌分离鉴定及促进食管鳞癌演进

目的分离、鉴定口腔变黑普雷沃氏菌(Prevotella nigrescens,P.nigrescens),探讨其对食管鳞癌是否有促进作用。方法胰豆胨肝粉琼脂(GAM)培养基厌氧原代培养慢性牙周炎患者龈沟液,挑选黑色菌落分离纯化;革兰染色、16S rRNA基因测序鉴定分离的单克隆细菌;该细菌感染食管鳞癌细胞NE6-T后细胞生物学性状变化。结果慢性牙周炎患者龈沟液厌氧原代培养120 h后可见多个菌落,其中灰黑色菌落经连续划线法分离纯化为黑色、圆形光滑单克隆菌落。该细菌革兰染色阴性、串珠状排列,16S rDNA序列与P.nigrescens F0103同源性为99.78%(P.nigrescens LY01)。LY01感染促进NE6-T细胞体外增殖、迁移、侵袭和裸鼠皮下荷瘤生长,并诱导Ki67表达上调和p-STAT3激活。结论慢性牙周炎口腔P.nigrescens可能促进了食管鳞癌发展。

菌毛素介导牙龈卟啉单胞菌对食管鳞癌促进作用

目的:探究牙龈卟啉单胞菌( Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)菌体表面菌毛素(fimbrillin, FimA)在 P. gingivalis促进食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)进展过程中的作用。 方法:野生型 P. gingivalis与 fimA基因缺失型 P. gingivalis( fimA-/-P. gingivalis)经形态学和PCR鉴定后感染ESCC细胞,免疫荧光、CCK-8、Transwell小室检测 fimA-/-对 P. gingivalis侵入细胞、增殖、迁移和侵袭能力影响,Western blot检测pSmad2/3变化,裸鼠皮下成瘤检测荷瘤生长。 结果:fimA-/-P. gingivalis与野生型 P. gingivalis比较,FimA缺失可能降低菌体间黏附, fimA-/-P. gingivalis侵入NE6-T细胞内细菌数目减少,刺激NE6-T和KYSE30细胞增殖、迁移和侵袭能力降低,pSmad2/3激活降低, fimA-/-P. gingivalis感染的KYSE30在裸鼠皮下生长较野生型 P. gingivalis明显降低。 结论:FimA介导了 P. gingivalis促进ESCC演进的作用,是阻断 P. gingivalis促肿瘤作用的潜在靶点分子。