猪流行性腹泻病毒变异株分离鉴定及攻毒模型建立

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性高度接触性肠道传染病。研究成功分离到一株PEDV,命名为PEDV-20200946。对该毒株的S基因进行测序分析,遗传进化树结果显示,该分离毒株属于G2亚群。通过Reed-Muench法测定该毒株毒价为106.1 TCID 50/mL。通过动物回归试验进一步探究该分离毒株对仔猪的致病情况,将12头20日龄仔猪平均分为3组,分别为口服攻毒组、口服+肌注攻毒组和对照组。攻毒后观察临床症状,72 h后采集各组的粪便及发病猪的肠道进行RT-PCR检测和免疫组化分析。结果显示,口服+肌注组仔猪发病最快,口服攻毒组次之,对照未发病。剖检攻毒组仔猪可见其肠壁变薄、肠道膨胀,内含大量黄色液体。免疫组化试验显示,攻毒组猪小肠内可检测到大量PEDV阳性信号,而对照组未检测到。研究建立了PEDV-20200946毒株仔猪攻毒模型,为深入研究PEDV流行毒株的分子特性以及弱毒疫苗的开发奠定基础。

山东省猪腹泻病例中PEDV、TGEV和PRV的感染调查与分析

为了解山东省规模化猪场由猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪伪狂犬病毒(PRV)引起猪病毒性腹泻的流行情况,自2014年1月至2016年12月,对来自山东省各地规模化猪场的猪腹泻病料(共3 035份)进行PCR检测。结果显示,PEDV、PRV和TGEV阳性率分别为67.49%、9.33%和3.29%;3年间,PEDV阳性率在2014年第四季度最低,为48.15%,2015年第四季度阳性率最高,为88.57%,2016年各季度阳性率相对2015年呈波动下降趋势;TGEV阳性率在2014年第四季度最高,为18.52%,2015年第三季度阳性率为15.38%,2016年第一季度阳性率为6.67%,其他季度未检测出阳性病料;PRV阳性率在2016年第二季度最高,为15.68%,除2014年第一季度未检出阳性病料外,2014年第二季度阳性率最低,为2.56%。通过对69份被动送检的病料进行PEDV、TGEV和PRV混合感染检测发现,这部分病料中PEDV、TGEV、PRV阳性率分别为86.96%、5.80%和37.68%;总单独感染率为69.57%,PEDV、TGEV和PRV单独感染率分别为57.97%、1.45%和10.14%;总混合感染率为30.43%,PEDV/PRV、PEDV/TGEV和TGEV/PRV混合感染率分别为26.09%、2.90%和1.45%;总单独感染率比总混合感染率高。结果表明,山东省存在PEDV、PRV和TGEV 3种病毒流行,存在PEDV/TGEV、TGEV/PRV和PEDV/PRV的混合感染,混合感染中主要为PEDV/PRV混合感染,不存在PEDV/PRV/TGEV的混合感染。目前PEDV是引起山东省猪病毒性腹泻的主要病因,本试验结果可为山东省猪病毒性腹泻的诊断和控制提供参考。

山东省2014—2015年主要猪病的监测

为给猪病防控措施的制定提供参考,2014—2015年对山东省主要猪群疫病进行了抗原抗体检测,分析其感染状况与流行趋势。结果显示:2014—2015年间,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)抗原阳性率由48.10%降低到40.56%,而其抗体阳性率由74.88%提高到84.39%。伪狂犬病(PR)抗原阳性率由4.07%提高到10.86%,期间的野毒(g E)抗体阳性率和免疫(g B)抗体阳性率基本一致。猪瘟(CFS)抗原阳性率由25.80%降低到12.61%,而其抗体阳性率由56.46%提高到71.54%。除CFS在2014年第二季度高发外,PRRS和PR的发生无明显季节性,三者的抗原阳性率与抗体阳性率大致呈负相关。猪流行性腹泻(PED)抗原阳性率由65.48%提高到77.73%,其在2014年第三季度高发,而在2015年全年高发。传染性胃肠炎(TGE)仅为零星发生。猪链球菌(SS)的抗原阳性率变化不大,平均为9%左右。副猪嗜血杆菌(HPS)抗原阳性率由30.42%降低到20.22%。总之,山东省PRRS和CFS等疫病的抗原感染率呈下降趋势,抗体阳性率呈上升趋势,说明山东省的主要猪病得到一定程度地控制。同时,依据生猪养殖业中存在的问题,提出了相应的防控对策。

猪流行性腹泻病毒JX16株的分离鉴定及体外传代对其毒力的影响

2010年中国新出现了以新生仔猪高发病率、高死亡率为主要特征的变异株。为了明确山东地区猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)变异株特征,本试验利用Vero细胞对莒县某猪场的腹泻病料进行了病毒分离和体外传代培养。通过光学显微镜和细胞超薄切片观察、RT-PCR检测、间接免疫荧光试验、S基因序列进化分析、滴度测定和致病力试验进行病毒序列及特征分析,并探究接毒后细胞脱落时间的变化。光学显微镜观察发现,该病毒感染Vero细胞后能引起典型的合胞体病变;细胞超薄切片观察发现,病毒粒子多呈致密核芯,能引起宿主细胞线粒体肿胀,溶解;RT-PCR检测和间接免疫荧光试验结果证实其为PEDV,最终通过测序证实该毒株为变异毒株。体外传代培养至100代过程中,随着病毒代次升高,其对细胞适应性不断增强。接毒后细胞脱落时间由48 h逐渐缩短至17 h,病毒滴度由6代时的105.3TCID50/mL逐渐升高至100代的107.5TCID50/mL。致病力试验结果显示,病毒毒力随代次升高逐渐下降,40代时对仔猪已无致病力。本试验结果为PEDV突变株致病基因的确定及疫苗的研发奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒变异毒株的分离鉴定及遗传演化分析

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪的一种急性高度接触性肠道传染病。为了解山东地区PEDV的遗传进化趋势,对2020—2021年收集的疑似猪流行性腹泻的临床病料进行RT-PCR检测。随后将处理好的病料上清液接种于Vero细胞进行PEDV病毒分离,并利用间接免疫荧光(IFA)进行验证,成功分离到一株PEDV毒株,命名为QH-202105。将分离株传代培养至第10代,提取RNA后进行扩增并全基因组测序,结合NCBI下载的参考序列对分离株的全基因组和S基因进行核苷酸同源性比对、系统发育树构建分析,结果显示,分离株与美国分离株USA/Colorado/2013核苷酸同源性最高,为99.1%,与CHM2013株同源性最低,为96.5%。经S基因氨基酸序列分析显示,分离株QH-202105在S基因的N端有60多处突变,两处氨基酸插入(包括第59~62位氨基酸的QGVN 4个氨基酸插入,第145位氨基酸N的插入)和两处氨基酸缺失(第115~118氨基酸的缺失,第167~168氨基酸的缺失)。进化树分析结果显示,分离毒株QH-202105为G2基因群,与CH/HNAY/2015和CH/ZJCX-1/2012亲缘关系最近,属同一进化分支。在此基础上,应用PROVEAN对QH-202105的S蛋白突变氨基酸进行功能预测,结果显示,在1361处(G→C)被判定为“Deleterious”,可以推测此处的突变对病毒的侵袭力可能存在间接影响。研究结果可为我国PEDV变异株的流行情况及防控提供参考。

“小胖”与“小瘦”的故事

小胖和小瘦的身世是个永远的谜。记得那是一个初冬的傍晚，我放学回家，刚下车就听到隔壁的楼洞里传来稚嫩的犬吠声。我好奇地向里张望，从楼道废弃的大柜子下面钻出来两个毛茸茸的小东西，

假如我是一块巧克力

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幸福是什么

经常有人问，幸福是什么？一千个人会有一千种答案。小女孩奶声奶气地回答：“能吃到巧克力就是幸福!”老人说：“如果能回到童年，那就是幸福!”胖胖的妇女说：“如果我的体重能降到100斤，那就是幸福!”著名歌星说：“能像普通人一样生活，那就是幸福!”

“趣考研”个性化移动端服务平台的设计与实现

近年出现的"考研热"掀起了大学生对考研类APP产品的大量需求,但目前市面上的此类程序仍存在考研院校信息不全面和国外考研相关资料缺乏等诸多不足,考研APP的开发潜力有待进一步发掘。构建大学生考研专业服务平台能够帮助学生明确考研方向、制订考研计划、寻找备考资料,从而提高考研人群的学习效率,促进校考的对接。

猪流行性腹泻病毒变异株的分离鉴定及其S基因序列分析

为分析山东省2016年上半年猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行株变异情况,用Vero细胞从仔猪临床腹泻样品中进行病毒分离,通过细胞病变(CPE)观察、聚合酶链式反应(PCR)方法、免疫荧光(IFA)试验、电镜观察、动物回归试验和测序分析,分离鉴定1株PEDV毒株(SDMY1401株).将该毒株进行S基因序列分析和遗传进化分析,结果表明该毒株为PEDV流行变异株.该毒株S基因核苷酸序列与山东省分离株CH-SDZC-2015和河南省分离株CHHNAY-2015同源性最高为99.4%,与疫苗毒株CV777同源性为94%.遗传进化分析表明该毒株与经典毒株DR13、疫苗毒株CV777及以前国内分离毒株在不同分支.

山东地区猪流行性腹泻病毒遗传变异分析及其单克隆抗体的制备

为了分析猪流行腹泻病毒(PEDV)在山东地区的流行和遗传变异情况,对2013—2015年收集的临床腹泻样品,参照GenBank中已经发表的PEDV毒株的N基因序列,设计1对特异性引物,利用RT-PCR技术检测PEDV抗原,并对其中的16份阳性样品进行病毒分离与S1基因测序分析。将含有PEDV流行株S1基因其中1个抗原表位(83~276aa)的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤细胞融合技术,筛选获得2株针对PEDV S蛋白抗原表位的杂交瘤细胞,其中1株(1E5)可以区分PEDV经典毒株和流行毒株。临床检测结果表明:PEDV临床检出率由2013年的57.8%提高到2015年的75.68%,PEDV在山东地区的发病季节除春冬季节,近年夏季也呈高发趋势,且各地区均有不同程度的感染。PEDV S1基因序列分析结果表明:分离到的16株PEDV毒株间的S1基因的核苷酸序列同源性为91%~99.8%,氨基酸序列同源性为87.8%~99.7%;山东分离毒株与15个国内外参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.5%~100%和88.4%~99.9%。对S基因分子流行病学分析发现,7个国外参考毒株、8个国内参考毒株与本次分离到的16个PEDV毒株被分为2个不同的进化分支G1和G2。在2013-2015年分离到的16株毒株中,有3株位于G1中,且距离CV777经典毒株较近;剩余的13株位于G2中,G2则以近年流行毒株为主,而山东分离株主要在G2分支中,这也解释了现有CV777疫苗毒株在山东地区的免疫保护力不佳的原因。本研究结果不仅从分子流行病学角度分析了山东地区PEDV的流行和变异情况,为指导该地区PEDV疫病防制提供了新的参考,并且制备了能够区分PEDV经典毒株和流行毒株的S蛋白单克隆抗体,为本病的实验室鉴别诊断提供了有效的检测工具和重要的理论基础。

四种常见猪肠道病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用

【背景】猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)和猪轮状病毒(porcinerotavirus,PoRV)是当前导致猪群发生病毒性腹泻的4种主要病原,并且常发生混合感染。【目的】建立一种可鉴别诊断这4种腹泻病毒病的检测方法,对于临床诊断具有重要意义。【方法】针对PEDV的M蛋白基因、TGEV的N蛋白基因、PDCoV的N蛋白基因和PoRV的VP7蛋白基因分别设计特异性引物,进而构建相应的重组质粒标准品。通过对PCR反应条件优化,建立可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的多重RT-PCR检测方法。随后通过敏感性、特异性和重复性试验对该方法的有效性进行验证。【结果】敏感性试验结果显示,对PEDV-M、TGEV-N、PDCoV-N和PoRV-VP7重组质粒标准品的最低检测下限分别为1.75×10^(2)、1.5×10^(3)、1.6×10^(2)和1.6×10^(2)copies/μL;特异性试验结果显示,仅可检出本研究中的4种靶病毒,而猪群常见病毒CSFV、PRRSV、PCV2和PRV未能检出。重复性试验结果显示,选取10^(8)、10^(6)和10^(4)copies/μL3个不同浓度的重组质粒作为模板,其他条件不变,分别进行5次重复试验,5次试验均扩增出清晰、均匀的条带。对山东各地区送检的52份临床腹泻样品通过建立的四重RT-PCR方法进行检测,发现PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的阳性率分别为37%(19份)、6%(3份)、10%(5份)和25%(13份)。其中PEDV和PoRV混合感染2份(4%),PEDV和TGEV混合感染2份(4%),PEDV和PDCoV混合感染1份(2%)。通过单重RT-PCR对该多重RT-PCR临床样品检测结果进行重复验证,结果显示多重RT-PCR与常规单重RT-PCR结果符合率为100%。最后随机挑选5个检测为阳性的临床样本进行测序验证,结果均为相应病毒的基因片段。【结论】本研究建立了可同时检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV的四重RT-PCR检测方法,研究结果为临床4种猪腹泻病毒病的鉴别诊断及流行病学调查提供了技术手段。

魅力夕阳

说起魅力，你的脑海中会浮现出怎样的场景？是几万人的演唱会，明星在舞台上载歌载舞；是国际T台上的服装走秀，灯光与霓裳互相辉映；是美国总统奥巴马的就职演说，吸引全球无数目光；是天安门前的国旗班，将五星红旗在国歌中迎风挥展。但是今天我要讲的魅力，它就存在于你我的身边，正如田野中一片片向日葵，迎着太阳悄悄绽放。