鲨鱼硫酸软骨素二糖组成分析及其4S/6S比值的讨论

目的研究鲨鱼来源硫酸软骨素的二糖组成,并对鲨鱼硫酸软骨素(shark-CS)4S/6S(N-乙酰半乳糖胺上4-硫酸化基团/N-乙酰半乳糖胺上6-硫酸化基团)比值进行探讨。方法通过酶解液相色谱法及文献比较对鲨鱼来源的硫酸软骨素二糖组成进行分析。结果鲨鱼硫酸软骨素主要由6-硫酸化软骨素二糖(ΔDi-6S)、4-硫酸化软骨素二糖(ΔDi-4S)、2,6-硫酸化软骨素二糖(ΔDi-2,6diS)以及无硫酸化的软骨素二糖(ΔDi-0S)组成,其百分含量分别为28%~65%、10%~44%、9%~25%、0.5%~23%。Shark-CS 4S/6S比值不超过0.8。结论提出Shark-CS 4S/6S比值的正确计算方法,解决了数据相互矛盾的问题。指出USP43中关于shark-CSΔDi-6S峰面积百分比大于ΔDi-4S峰面积百分比的不合理规定,为USP43修订提供参考与依据。

发菜藻蓝蛋白基因克隆及原核表达

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,具有重要的经济和生态价值。运用双向电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS鉴定和数据库检索,获得藻蓝蛋白部分氨基酸序列并设计简并性引物,克隆藻蓝蛋白基因并研究其表达。结果表明,发菜藻蓝蛋白α和β亚基两个基因的编码序列及两者之间的间隔序列全长为1097bp,编码β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp,β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游,两者之间通过89bp的基因片段连接,GenBank登录号为GU549478,并对推译的α和β亚基三维结构进行了预测。将藻蓝蛋白的α和β亚基基因在大肠杆菌中表达,获得了符合预期的外源重组蛋白。研究结果为进一步研究发菜藻蓝蛋白的分子结构及生物学功能奠定了基础。

发菜耐旱相关蛋白NXL-01的基因克隆与表达分析

在发菜耐旱差异蛋白质组学研究中,发现假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加。根据已知氨基酸序列设计简并引物克隆NXL-01基因,长度为327bp(GenBank登录号为HM854288)。生物信息学分析表明,该基因具有较高保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成,是亲水性的膜外蛋白,有5个Ser磷酸化位点,1个Thr磷酸化位点。将NXL-01基因在大肠杆菌中表达,获得预期大小的重组蛋白(12.4kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐增加,与NXL-01蛋白的表达趋势一致。

发菜蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

为建立适用于发菜（Nostoc flagelliforme）蛋白质组研究的双向电泳技术，对发菜蛋白质的提取、裂解、上样量、IEF及SDS-PAGE电泳等关键步骤进行了优化，结果显示：发菜蛋白质主要分布在pH4～7范围内，采用改良TCA法可提高提取液中蛋白质的含量和双向电泳图谱的分辨率，裂解液含60mmol／LDTT，24cm IPG胶条上样量1．5mg时不仅提高了蛋白质的溶解性，而且改善了双向电泳的分离效果，得到近800个蛋白点，且蛋白点清晰，图谱分辨率较好。采用优化后的双向电泳体系提高了发菜蛋白质双向电泳的分辨率和重复性，建立起一套适用于发菜蛋白质组分析的双向电泳方法。

干燥和复吸水条件下发菜Mn-CAT差异表达与基因克隆

运用双向凝胶电泳技术、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜锰过氧化氢酶(Mn-CAT)在干燥和复吸水后的差异表达水平,根据Mn-CAT鉴定的已知氨基酸序列设计简并引物克隆该基因,并研究其原核表达.结果表明:干燥发菜复吸水后Mn-CAT表达量明显高于干燥状态下的表达量.使用简并引物克隆获得长度为693 bp的Mn-CAT基因(GenBank登录号为GU549477).将Mn-CAT基因在大肠杆菌中表达,获得1个约26 kD的外源蛋白,经Western blotting验证,该外源蛋白为Mn-CAT.研究结果为进一步研究发菜耐旱的分子机理、探讨发菜对极端干旱环境的适应机制奠定了基础.

干旱胁迫条件下发菜Ferritin差异表达与基因克隆

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,具有强烈的旱生生态适应性。运用双向电泳技术、凝胶图像分析、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,发现发菜Ferritin在干旱胁迫条件下表达量逐渐降低。根据鉴定的Ferritin已知氨基酸序列设计简并性引物克隆该基因,获得了长度为540 bp的DNA,GenBank登陆号为HM854287。序列比较显示该基因具有较高的保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋和随机卷曲构成。RT-PCR分析表明,Ferritin mRNA在干旱胁迫条件下表达量逐渐降低,与Ferritin的表达趋势一致。将Ferritin基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白(22.4 kD)。实验结果可为进一步研究发菜耐旱的分子机理及探讨发菜对极端干旱环境的适应和保护机制奠定基础。

三种方法测定鲨鱼硫酸软骨素钠含量的比较

利用酶解高效液相色谱法、高效液相色谱法及氯化十六烷基吡啶电位滴定法对鲨鱼硫酸软骨素钠含量进行检测,并对检测结果进行对比分析,结果显示,酶解高效液相色谱法不适用于鲨鱼硫酸软骨素钠含量的测定;而氯化十六烷基吡啶电位滴定法检测鲨鱼硫酸软骨素钠含量稍高于高效液相色谱法;相比之下,高效液相色谱法较适用于检测鲨鱼硫酸软骨素钠含量。

干燥和复吸水条件下发菜过氧化物氧还蛋白差异表达与基因克隆

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,为探讨其耐旱的分子机理及对极端干旱环境的适应和保护机制,运用双向电泳技术(2-DE)、凝胶图像分析、MALDI-TOF-TOF/MS质谱鉴定和数据库检索,分析发菜过氧化物氧还蛋白(Peroxiredoxin)在持续干燥48 h和复吸水4 h后的差异表达水平,根据鉴定的过氧化物氧还蛋白已知氨基酸序列设计简并性引物克隆该基因,分析基因和氨基酸序列的同源性及对蛋白质二级结构进行预测,并研究其原核表达.结果表明,发菜过氧化物氧还蛋白在复吸水后的表达量明显高于干燥状态下的表达量。根据简并性引物克隆获得长度为639 bp的过氧化物氧还蛋白基因,GenBank登陆号为HM854286.序列比较分析显示该基因具有较高的保守性,蛋白质二级结构主要由α螺旋、β折叠和随机卷曲构成.将过氧化物氧还蛋白基因在大肠杆菌中表达,获得符合预期的外源重组蛋白(26.5×103),经Western blotting验证,该外源蛋白为过氧化物氧还蛋白.