CRISPR/Cas9技术在作物遗传育种中的应用进展

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9)是继 ZFNs(Zinc finger nucleases)和TALENs(Transcription activator like effector nucleases)之后出现的新型基因组定点编辑技术,相较于前两代技术,具有简便、高效等特点。CRISPR/Cas9不仅是一种基础性研究工具,而且已经成为目前有用的分子育种工具之一,在作物遗传改良方面取得重要应用进展。综述了 CRISPR/Cas9系统的结构、分类、作用机制及在作物品质改良、产量提升、抗性育种和雄性不育材料选育中的应用进展,并探讨了其存在的问题,展望了其应用前景。

转NPR1和CHR3抗病基因提高大豆对疫霉根腐病抗性研究

为检测GmCHR3和广谱抗病基因NPR1双抗基因转化到大豆吉林30中的遗传稳定性和抗病能力,从而为培育出抵抗疫霉根腐病大豆新品种提供有效参考,以大豆品种吉林30转CHR3抗病基因转化品系JL30+GmCHR3为目标受体材料,以吉林30为对照受体材料,利用农杆菌介导法将NPR1导入受体中。利用常规PCR检测基因转化情况,利用Southern杂交和qRT-PCR技术分别鉴定JL30+GmCHR3受体和双抗基因转化株系T1和T2代中两个基因的整合和表达情况,采用下胚轴侵染法鉴定转基因大豆植株对疫霉根腐病的抗性。PCR研究结果显示:转化元件的启动子35s、终止子Nos、筛选标记基因Bar以及目的基因NPR1全部转入到受体基因组中;NPR1基因以单拷贝的形式在转化植株中完成整合;NPR1基因在大豆植株根、茎和叶中均有表达,其中T1代株系在3个部位的相对表达量分别是2.732,1.614和3.316,T2代株系的相对表达量分别是2.936,2.084和3.864;NPR1基因在各组织中的相对表达量为茎<根<叶。CHR3和NPR1双抗基因转化株系对疫霉根腐病表现为高抗,NPR1单抗基因转化株系表现为中抗,非转基因吉林30植株表现为感病。结果说明大豆吉林30转入双价抗病基因GmCHR3和NPR1可以增强其对疫霉根腐病的抗性。

NPR1和Cry1Ab13-1基因双价植物表达载体的构建及在玉米中的转化

单一的抗病、抗虫品种已经不能满足需求,因此,本研究通过基因工程技术构建同时具有抗病基因NPR1基因和抗虫基因Cry1Ab13-1基因并以bar基因为筛选标记的植物双价表达载体并进行遗传转化,以获得优良的特点同时兼具抗病抗虫的新株系。通过农杆菌介导法、花粉管通道法和超声波介导法将构建好的植物表达载体在玉米中进行遗传转化,并对T_(2)代转基因植株进行PCR检测、Southernblotting整合度检测、实时荧光定量PCR转录水平检测、室外抗虫以及室内抗病初步鉴定。结果表明:共获得T_(2)代PCR阳性植株14株。Southern Blot结果表明,NPR1和Cry1Ab13-1双价基因已经分别以单拷贝形式整合到玉米受体中。实时荧光定量PCR结果表明NPR1和Cry1Ab13-1双价基因在不同组织间相对表达量均高于阴性对照,NPR1基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为3.302、1.45、9.75;Cry1Ab13-1基因在根、茎、叶中相对表达量均值分别为3.15、1.61、9.89。室外接虫抗虫性鉴定结果表明阳性植株接虫处理7 d后虫子存活率为3.28%,而10d后虫子存活率为2.06%,抗虫级别由受体的感虫级别提高到中抗级别;室内抗病鉴定表明阳性植株抗病等级为高抗,而受体植株则为中抗,抗病能力明显提高。

抗病基因PR1在大豆中的遗传转化与多抗材料的培育

单一抗病、抗虫品种在农业生产中已经不能满足需要,本研究通过基因工程技术构建抗病基因pCAMBIA-3301-PR1表达载体,通过花粉管通道法转化外源抗病基因PR1到含有CryAB-13-1转基因高世代受体大豆中,得到兼具抗病抗虫新材料。对T_(2),转基因植株进行常规PCR检测,SouthernBlot杂交,Real TimePCR检测,室内、室外抗虫鉴定,室内抗病鉴定。结果表明,在T_(2)代常规PCR检测中,阳性植株共15株。SouthernBlot杂交结果显示,PR1与CryAB-13-1基因均以单拷贝子的形式整合在大豆中。Real Time PCR表明PR1和CryAB-13-1基因在不同组织中表达量有差异,PR1基因在植物根、茎、叶中表达量平均分别为2.88、1.48、5.86,CryAB-13-1基因在根、茎、叶中表达量平均分别为3.03、1.32、7.11。室外抗虫鉴定阳性植株CryAB-13-1基因的植株虫食率为3.47%,抗虫级别上属于R-抗,抗虫级别从感虫到抗虫级别。室内采用圆盘分隔法进行抗虫鉴定,转化植株芽长有明显增长。室内抗病鉴定未转化植株平均死亡率高达58.34%,转化PR1基因植株平均死亡率为15.38%,抗病能力明显提高。因此得到兼具抗病抗虫新材料。