小鼠经骨髓注射肺转移和术后复发模型的建立

目的建立经骨髓注射肺转移和术后复发模型,揭示骨髓注射法构建模型的优越性和可行性,为研究恶性肿瘤肺转移提供新的研究基础。方法将小鼠分为乳垫注射组、皮下注射组、尾静脉注射组和骨髓注射组。使用4T1细胞构建不同的模型,观察不同组别原发肿瘤的生长、生存期和转移效率。注射不同数量的4T1细胞,观察肺部转移发生的时间。经骨髓注射4T1-luc细胞构建术后复发模型,将小鼠分为假截肢组、第3天截肢组、第7天截肢组和第10天截肢组,通过活体成像观察小鼠肺转移情况。结果与乳垫注射法和皮下注射法相比,骨髓注射法对原发肿瘤的生长没有影响,但其生存期显著缩短。与乳垫注射法、皮下注射法和尾静脉注射法相比,骨髓注射法肺转移效率最高。骨髓注射法仅需1×105个4T1细胞数量即可在第12天发生肺转移。经骨髓注射的模型小鼠在截肢后,仍会造成肺转移和原发肿瘤的复发。结论成功建立经骨髓注射肺转移小鼠模型和术后复发小鼠模型,使用该注射方法的小鼠模型具有生存期短和高转移效率的特点,可用于恶性肿瘤肺转移的机制研究及药物筛选。

副凋亡在肿瘤中的研究进展

肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一,流行病学数据显示,2018年全球约有1810万肿瘤新发病例以及960万肿瘤死亡病例;肿瘤的发病率和死亡率在全球范围内迅速增长,其难治性及危害性使得肿瘤成为全球最重要的生命科学领域之一[1]。细胞死亡方式的研究对于肿瘤有重要意义,如细胞凋亡的发现对肿瘤细胞的清除及肿瘤治疗学产生了巨大影响,但单一方式的治疗常常伴随耐药性的产生[2-4];与此同时,诱导肿瘤细胞其它死亡形式在临床抗肿瘤治疗中也发挥重要的作用[5]。

髓源抑制细胞在非肿瘤疾病中的研究进展

髓源抑制细胞(MDSC)是来源于骨髓的一群具有免疫抑制作用的异质性细胞群体,在病理状态下扩增,发挥调节机体自身免疫的作用。MDSC的早期研究聚焦于其在肿瘤微环境中的免疫抑制活性方面,近年逐渐有研究者将视角拓展至其在自身免疫性疾病、器官移植、妊娠和炎症等非肿瘤领域的作用。在非肿瘤疾病中,MDSC在一定程度上发挥正向调节作用,其通过调节T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞,抑制过激的免疫反应,进而影响疾病的发展。加强MDSC在非肿瘤疾病中作用的研究,才能更加全面地认识MDSC,从而更好地阐明MDSC在不同疾病中的作用。

肿瘤微环境中单核细胞样髓源抑制细胞M-MDSCs的免疫抑制作用及其相关治疗的研究进展

肿瘤微环境(TME)在肿瘤发生发展中发挥重要促进作用。广泛存在于TME中的髓源抑制细胞(MDSCs)是介导肿瘤免疫逃逸的主要效应细胞群。单核细胞样髓源抑制细胞(M-MDSCs)作为MDSCs中除中性粒细胞样髓源抑制细胞(PMN-MDSCs)以外的另一主要亚型,因其具备PMN-MDSCs不具备的广谱免疫抑制活性和高度可塑性,即M-MDSCs在癌症初期被招募至肿瘤部位,对T细胞、NK细胞等发挥直接免疫抑制作用,另可分化为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、炎症性树突状细胞(Inf-DCs)和PMN-MDSCs,从而增加肿瘤治疗难度,故研究者逐渐把目光由数量上占主导的PMN-MDSCs转向占比较少的MMDSCs。根据M-MDSCs在TME中募集迅速、分化多样和功能复杂的特点,以其为靶点的免疫疗法可从耗竭数量、干预分化和抑制功能3方面入手,以期增强临床抗肿瘤疗效。虽然国内外PMN-MDSCs研究颇丰,但聚焦于M-MDSCs的中文综述鲜有报道,本文拟从TME中M-MDSCs特点出发,首次对M-MDSCs免疫抑制作用及其靶向治疗进行综述。

血清COL4A3蛋白与非小细胞肺癌(NSCLC)患者临床病理特征及预后的相关性

目的探索血清COL4A3蛋白与非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者临床病理特征及预后的相关性。方法 ELISA试剂盒检测90例NSCLC患者和58名健康对照血清中COL4A3蛋白含量。ROC曲线分析血清COL4A3水平以预测NSCLC患者肿瘤转移的敏感性与特异性。Kaplan-Meier生存分析研究血清COL4A3蛋白表达与患者生存期的相关性。对NSCLC患者预后的相关性因素进行单因素和多因素分析。采用MTT实验和Transwell实验分别检测血清COL4A3蛋白对NSCLC细胞增殖和迁移能力的影响。结果 NSCLC患者血清COL4A3水平明显高于健康对照( P <0.001),且高表达COL4A3的患者总生存期(overall survival,OS)低于低表达患者( P =0.021)。在单因素分析中,NSCLC患者预后与肿瘤大小( P= 0.015 )、病理组织分级( P= 0.042)、淋巴结转移( P= 0.015)、临床分期( P <0.01)以及COL4A3表达( P <0.01)密切相关;在多因素分析中,NSCLC患者的预后与患者淋巴结转移( P= 0.032)、临床分期( P < 0.01 )以及血清COL4A3水平( P= 0.012)密切相关。 COL4A3蛋白可显著增强体外NSCLC细胞增殖和迁移能力,并呈浓度依赖性。结论血清COL4A3 蛋白水平与NSCLC进展密切相关,可能是一种NSCLC患者预后不良的独立标志物。

黄芪甲苷通过诱导M1型巨噬细胞极化发挥抗肿瘤作用的机制

目的:探讨黄芪甲苷对巨噬细胞极化的影响及其可能的抗肿瘤免疫机制。方法:通过噻唑兰(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法检测不同浓度黄芪甲苷作用不同时间,对巨噬细胞的细胞毒作用,以选取合适的黄芪甲苷作用浓度;将巨噬细胞与肿瘤细胞以1∶1进行共孵育,并用0. 1 mg·L^-1黄芪甲苷作用24 h,通过虫荧光素酶(luciferase,Luc)杀伤实验检测巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤效率;以0. 1 mg·L^-1黄芪甲苷作用巨噬细胞24 h,通过流式细胞术检测巨噬细胞CD16/32,CD206表达,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测巨噬细胞诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS),精氨酸-1(Arginine-1,Arg-1)及细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β),肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12),白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10),转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) mRNA表达,通过蛋白免疫印迹法(Western blot)检测巨噬细胞信号传导及转录激活因子1(Signal transducers and activators of transcription 1,STAT1),磷酸化信号传导及转录激活因子1(phosphorylation signal transducers and activators of transcription 1,p-STAT1)表达。结果:当黄芪甲苷质量浓度为0. 1 mg·L-1时,对巨噬细胞无细胞毒作用。与空白组比较,Luc杀伤实验结果显示黄芪甲苷可以显著促进巨噬细胞介导的肿瘤杀伤;Real-time PCR结果显示黄芪甲苷可以诱导巨噬细胞表面M1型巨噬细胞标志CD16/32表达增高,促进M1型巨噬细胞特异性指标i NOS mRNA表达,同时诱导M1型巨噬细胞相关细胞因子IL-1β,TNF-α,IL-12 mRNA表达增高;Western blot结果显示黄芪甲苷可以促进巨噬细胞STAT1发生磷酸化。结论:黄芪甲苷可以通过促进巨噬细胞内STAT1发生磷酸化,进而诱导巨噬细胞向M1型巨噬细胞发生极化,并启动巨噬细胞相关的抗肿瘤免疫应答。

基于网络药理学和体外实验探讨驻景丸治疗老年性黄斑变性的作用机制

目的运用网络药理学和体外实验探讨驻景丸治疗老年性黄斑变性(AMD)的作用机制。方法检索Genecards、OMIM数据库与AMD相关的作用靶点,使用Jvenn在线工具获取驻景丸活性成分与AMD的交集靶点,构建“药物-成分-靶点”网络以及蛋白互作(PPI)网络。采用DAVID数据库对交集靶点的GO功能和KEGG通路富集分析,将网络中度值较高的成分与靶点进行分子对接。通过体外MTT实验和Western Blot实验,使用驻景丸有效成分干预人视网膜色素上皮细胞(ARPE19),进行核心靶点和通路的初步验证。结果网络药理学结果显示,共筛选出驻景丸中38个活性成分、150个交集靶点。蛋白互作网络显示关键靶点有MAPK1、Akt1、VEGFA等。GO富集分析涉及到247个生物过程、36个细胞组分和64个分子功能。KEGG通路分析得到HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、前列腺癌等85条相关通路。分子对接结果显示驻景丸治疗AMD的主要活性成分可以与MAPK1、Akt1、STAT3和MAPK3有较稳定的结合,其中Akt1与异鼠李素结合性最强。MTT结果显示驻景丸活性成分异鼠李素、槲皮素和山柰酚均可以促进碘酸钠损伤的ARPE19细胞增殖(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。Western Blot结果证实碘酸钠通过激活STAT3信号通路诱导细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP、BAD表达(P<0.01,P<0.001),异鼠李素、槲皮素和山柰酚则可以通过抑制STAT3信号通路进而抑制Caspase-3、PARP、BAD凋亡蛋白表达(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。结论本研究从网络药理学角度预测了驻景丸治疗AMD的药效物质基础及分子机制,并通过体外实验进行核心靶点和通路的初步验证,为驻景丸等中药复方研究提供了新的思路。

泽漆汤对肺癌原位模型小鼠的抑制作用

目的:建立小鼠肺癌原位模型,用泽漆汤干预模型小鼠以观其抑瘤功效,并探索潜在作用机制。方法:通过肺内注射1×10^5个LLC-luc细胞建立非小细胞肺癌原位小鼠模型,用泽漆汤(0. 171 g·m L^-1)或生理盐水对模型小鼠进行每日灌胃,连续35 d,观察小鼠的外观表现(精神、毛发、食欲等),生存期及泽漆汤抑瘤效果;每周活体成像检测小鼠肺内荧光信号强弱。流式细胞术检测模型小鼠脾脏中NK细胞数量,CD107α实验检测泽漆汤用药后小鼠脾脏中NK细胞脱颗粒情况。采用Kromasil 1005 C18色谱柱,以0. 025%磷酸-乙腈梯度洗脱,流速1. 0 m L·min^-1,柱温35℃,检测波长265 nm,建立泽漆汤指纹图谱并采用中国药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版)对10批样品指纹图谱进行评价以完成对泽漆汤的质量控制。结果:泽漆汤能够明显抑制肺癌原位模型小鼠肺部荧光信号(P <0. 05,P <0. 01),延长小鼠生存期(P <0. 01);泽漆汤干预后小鼠体内肿瘤中NK细胞显著增多(P <0. 01),CD107α脱颗粒也显著增加(P <0. 01)。并且,对泽漆汤指纹图谱的相似度评价结果显示,10批泽漆汤水提液的指纹图谱相似度均≥0. 9,表明不同批次间差异较小。结论:泽漆汤可能通过上调小鼠体内NK细胞数量,增强其脱颗粒能力,从而达到抑制小鼠体内肿瘤生长,延长其生存期的作用。泽漆汤HPLC指纹图谱相似度评价可反映泽漆汤质量的稳定性,为后续研究提供用药基础。

芩麻方通过调控髓源抑制细胞抑制非小细胞肺癌的机制研究

目的研究芩麻方对肺癌原位模型小鼠的抑瘤功效及可能作用机制。方法通过给小鼠肺内注射非小细胞癌Lewis肺癌细胞-荧光素酶标记(LLC-luc)建立肺癌原位小鼠模型。将所有造模小鼠随机分为空白对照组,顺铂组(2 mg/kg腹腔注射,每周2次),芩麻方高、中、低剂量组(2.0、1.0、0.5 g/kg,每日1次),连续给药4周。观察小鼠的外观表现(精神、毛发、活动等)并统计生存期。MTT法检测芩麻方对LLC-luc细胞增殖的抑制作用。流式细胞术检测小鼠脾脏和肿瘤中髓源抑制细胞(MDSCs)和T细胞数量变化,以及CD8+T细胞CD107α脱颗粒状况。RT-PCR检测小鼠脾脏中精氨酸酶(Arg1)、一氧化氮合酶(iNOS)、信号转导和转录活化因子3(STAT3)、信号转导和转录活化因子1(STAT1)基因表达。Western blot法检测小鼠脾脏中Arg1、STAT3和p-STAT3蛋白表达。HE染色和ELISA检测不同剂量的芩麻方的肝肾毒性。结果中剂量芩麻方可延长小鼠生存期(P<0.05);不同质量浓度的芩麻方干预对LLC-luc肺癌细胞增殖并无直接抑制作用;中剂量芩麻方可降低小鼠脾脏、肿瘤中MDSCs的数量(P<0.01),增加T细胞的数量,且以CD8+T细胞为主(P<0.01),同时增强CD8+T细胞CD107α脱颗粒作用(P<0.01);中剂量芩麻方干预后,与MDSCs活化相关的Arg1、STAT3 mRNA表达水平降低,Arg1、STAT3和p-STAT3蛋白表达下调(P<0.01);芩麻方干预对小鼠肝肾组织切片及生化指标无显著影响。结论芩麻方可能通过下调STAT3信号通路抑制MDSCs增殖和活化从而延长肺癌荷瘤小鼠生存期,且具有用药安全性。该研究有利于芩麻方临床应用的拓展,同时也丰富了肺癌痰污染理论的科学内涵。

芦荟苦素对非小细胞肺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究芦荟苦素诱导人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC) A549细胞发生凋亡,从而抑制其增殖的作用机制。方法:取对数生长期的A549细胞,用细胞计数试剂(cell counting kit,CCK-8)检测考察不同浓度的芦荟苦素(0,2,4,8,16,32,64,128μmol·L^-1)对A549细胞增殖的影响,5μmol·L-1的顺铂作为阳性对照。用结晶紫染色测定芦荟苦素(0,16μmol·L^-1)对A549细胞克隆形成的数目以及克隆形成的大小的作用;磷脂酰丝氨酸结合蛋白V/碘化丙啶(annexin V/propidium iodide,PI)凋亡试剂盒染色检测芦荟苦素对A549细胞凋亡的影响;赫斯特(Hoechst)染色检测细胞凋亡核固缩现象;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测芦荟苦素对A549细胞中的B细胞淋巴瘤-特大型蛋白(B-cell lymphoma-extra large,Bclxl),B细胞淋巴瘤-特大型/B细胞淋巴瘤-2联合死亡促体(Bcl-xl/Bcl-2 associated death promoter,Bad),裂解半胱天冬酶-3[cleaved-Caspase3,cl-Caspase-3(Asp175)],半胱天冬酶-3(Caspase-3),裂解核糖聚合酶(cleaved-poly ADP-ribose polymerase,clPARP),核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)凋亡相关蛋白表达的影响。体内实验将5周龄裸鼠皮下接种2×10^6个A549细胞,并随机分为用药组和空白组,连续4周每天分别进行芦荟苦素或生理盐水腹腔注射,每周测量裸鼠肿瘤体积和小鼠体质量,并观察裸鼠的外观表现(精神、毛发、食欲、睡眠等)。结果:芦荟苦素呈浓度依赖性抑制A549细胞增殖及克隆形成的数量和大小(P <0. 05)。经芦荟苦素处理后,A549细胞凋亡的数量以及细胞发生核固缩的现象明显增加(P <0. 01),同时,芦荟苦素还明显下调了凋亡相关蛋白Bcl-xl的表达(P <0. 05),增加Bad蛋白表达(P <0. 01),同时还明显升高了cl-PARP(P <0. 01)和cl-Caspase-3(P <0. 05)表达水平。此外,在体内,芦荟苦素可明显缩小小鼠皮下肿瘤的体积,减轻肿瘤质量,并且小鼠外观表现优于空白组。结论:芦荟苦素可能通过诱导A549细胞凋亡从而达到抑制NSCLC的作用,并且用药安全。