血必净注射液通过上调claudin-5改善硫化氢诱导的肺血管屏障功能失调

目的从细胞紧密连接蛋白claudin-5的角度探讨血必净注射液改善肺血管屏障功能紊乱的新机制。方法采用硫化氢(H2S)暴露导致急性肺损伤(ALI)模型。①体内实验:按随机数字表法将雄性SD大鼠分为对照组、H2S暴露组(300×10^-6 H2S持续暴露3 h)、血必净对照组(静脉注射血必净注射液4 mL/kg、每日2次、持续3 d)、血必净干预组(血必净注射液预处理后予以H2S暴露),每组6只。制模成功后不同时间点(0、6、12、24 h)分别检测大鼠血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白含量,计算肺通透性指数(PPI;PPI=BALF中总蛋白含量/血浆中总蛋白含量),测定肺湿/干重比值(W/D),用实时定量聚合酶链反应检测肺组织claudin-5 mRNA表达。②体外实验:将人肺微血管内皮细胞株(HPMECs)分为空白对照组、H2S供体(NaHS)处理组(与500μmol/L NaHS共孵育12 h)、血必净对照组(加入2 g/L血必净注射液培养24 h)、血必净干预组(2 g/L血必净注射液预处理24 h后与500μmol/L NaHS共孵育12 h)。分别于共孵育不同时间点(1、3、6、12和24 h),用蛋白质免疫印迹试验检测HPMECs细胞claudin-5蛋白表达,以荧光素钠评价单层HPMECs的通透性。结果①体内实验结果:与对照组相比,大鼠H2S暴露后6 h肺W/D比值即显著升高,12 h达峰值(4.67±0.11比4.26±0.06,P<0.01);肺组织claudin-5 mRNA表达显著降低,暴露后6 h时降至对照组的89%(P<0.01)。暴露后12 h BALF中总蛋白和PPI均显著高于对照组〔总蛋白(mg/L):262.31±14.24比33.30±3.09,PPI:(11.72±0.57)×10^-3比(1.21±0.08)×10^-3,均P<0.01〕;而血必净预处理后BALF中总蛋白和PPI均显著下降〔总蛋白(mg/L):153.25±7.32比262.31±14.24,PPI:(5.79±0.23)×10^-3比(11.72±0.57)×10^-3,均P<0.01〕。②体外实验结果:与空白对照组相比,HPMECs与NaHS共孵育后单层内皮细胞通透性逐渐增加,12 h达到最高,约为空白对照组的2倍(P<0.01),而claudin-5蛋白表达则于12 h时降至最低(claudin-5/β-actin:0.42±0.03比1.03±0.05,P<0.01);经血必净干预后可明显改善内皮细胞通透性(荧光素钠的荧光强度:1.46±0.10比1.89±0.11,P<0.01),减轻claudin-5蛋白的下降程度(claudin-5/β-actin:0.68±0.04比0.38±0.03,P<0.01)。结论血必净注射液可能通过上调claudin-5的表达改善ALI时受损的肺血管屏障功能。

血必净注射液通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路上调claudin-5表达改善ARDS大鼠肺血管屏障功能

目的探讨血必净注射液上调紧密连接蛋白claudin-5表达的信号通路。方法利用脂多糖(LPS)建立急性呼吸窘迫综合征(ARDS)动物模型和细胞模型。①体内实验:将20只雄性SD大鼠随机分为4组,每组5只。正常对照组大鼠不做任何处理;LPS诱导组腹腔注射10 mg/kg LPS 12 h;血必净对照组腹腔注射1 mg/kg血必净注射液,每日2次,连续3 d;血必净干预组用血必净注射液预处理后腹腔注射10 mg/kg LPS 12 h。取大鼠肺脏,检测肺湿/干质量比值(W/D)和大鼠肺组织形态学改变;免疫组织化学染色(IHC)和蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测大鼠肺组织claudin-5、磷酸化叉头框蛋白O1(p-FOXO1)、总叉头框蛋白O1(t-FOXO1)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-Akt)、总Akt(t-Akt)蛋白表达。②体外实验:将人肺微血管内皮细胞(HPMECs)分为6组,每组5孔。正常对照组、血必净对照组(与2 g/L血必净共同孵育24 h)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)通路抑制剂LY294002对照组(与10μmol/L LY294002共同孵育1 h)、LPS诱导组(与1 mg/L LPS共同孵育12 h)、血必净干预组(用2 g/L血必净预处理24 h后与1 mg/L LPS共同孵育12 h)、LY294002干预组(与10μmol/L LY294002共同孵育1 h后加入2 g/L血必净孵育24 h,然后再与1 mg/L LPS共同孵育12 h)。用Western blotting检测每组HPMECs中claudin-5、p-FOXO1、t-FOXO1、p-Akt、t-Akt蛋白的表达。结果体内实验结果:①肺组织W/D比值:LPS诱导组较正常对照组显著升高(6.79±0.42比4.19±0.13),经血必净干预后较LPS组明显下降(4.92±0.38比6.79±0.42,P<0.01)。②肺组织形态学改变:与正常对照组比较,LPS诱导组损伤严重,经血必净干预后明显改善。③claudin-5、p-Akt/t-Akt、p-FOXO1/t-FOXO1蛋白表达水平:LPS诱导组各蛋白均较正常对照组明显降低〔claudin-5蛋白(claudin-5/GAPDH):0.33±0.03比1.03±0.07,p-Akt/t-Akt:0.18±0.02比1.01±0.13,p-FOXO1/t-FOXO1:0.16±0.06比1.00±0.19,均P<0.01〕;经血必净干预后表达水平较LPS诱导组显著增高〔claudin-5表达(claudin-5/GAPDH):0.53±0.05比0.33±0.03,p-Akt/t-Akt:0.56±0.12比0.18±0.02,p-FOXO1/t-FOXO1:0.68±0.10比0.16±0.06,均P<0.01〕。体外实验结果:LPS诱导组及血必净干预组claudin-5蛋白均较正常对照组明显降低(claudin-5/β-actin:0.45±0.03、0.80±0.08比1.01±0.15,均P<0.01);LY294002干预后claudin-5表达较血必净干预组明显下降(claudin-5/β-actin:0.41±0.02比0.80±0.08,P<0.01)。结论血必净通过PI3K/Akt/FOXO1信号通路上调claudin-5,从而改善ARDS的肺血管屏障功能。