辐射损伤骨髓造血细胞的DNA含量及AgNOR定量分析

LACA小鼠经60 Coγ射线全身一次照射 ,对骨髓组织切片和骨髓细胞悬液涂片 ,分别采用改良的Feulgen染色及核仁组成区相关蛋白 (AgNOR)染色 ,利用图像分析技术对在不同照射剂量、不同时间点的造血细胞核内DNA及AgNOR含量进行了定量分析。结果显示各照射组在2 5 - 7 0Gy剂量、 6h～ 4周范围内 ,骨髓均出现明显损伤及损伤后重建现象 ,且剂量越大 ,损伤越重 ,恢复亦较慢 ;其中以 5 5Gy组骨髓细胞核内DNA和AgNOR含量变化最为典型 ,在损伤早期进行性减少 ,而在恢复期出现持续性增加 ,直至恢复正常。结果提示 :骨髓造血细胞核内AgNOR及DNA含量的变化可以作为反映骨髓辐射损伤与修复程度的定量指标。

LSAB免疫组化方法的改进及在血液和骨髓病理学中的应用

ＬＳＡＢ免疫组化方法即标记的抗生收白链菌素生物素方法。它是将抗生蛋自链菌素应用于免疫组化染色技术建立起的一种新的免疫组化染色方法，具有快速和高敏感的特点。目前被认为是最理想的免疫组化染色方法。文献报道的方法是用ＨＲＰ标记ＳＡ，显色剂为ＤＡＢ。但在实际科研工作中，由于血液及骨髓内的血细胞本身含较多的内源性过氧化物酶，仅凭Ｈ２Ｏ２阻断是完全不够的，即不能应用ＤＡＢ显色。

原位末端标记方法的改进及其在检测骨髓造血细胞凋亡中 …

细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，又称程序性细胞死亡。在实际研究工作中，特别是检测骨髓和含血细胞较多的组织过程中，由于内源性过氧化物酶含量较多，使用ＤＡＢ底物显色将会产物不可避免的背景着色，影响检测效果。因此，为了不影响检测结果（防止假阳性），探索性地将亲和素－辣根过氧化物酶改为碱性酸酶标记的抗生蛋白链菌素（ＡＰ－ＳＡ）；显色剂由ＤＡＢ改为坚固红。阳性结果为玫瑰红色，核复染后呈蓝色，反差明显。

知母有效成分对拟痴呆模型大鼠学习记忆的影响及机制

目的研究知母有效成分(化合物9714)对拟血管性痴呆(VD)模型大鼠学习记忆的影响及其作用机制。方法采用双侧颈总动脉结扎(Commoncarotidarteryocclusion,CCAO)致拟VD模型大鼠,连续给药40d,以Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,以免疫组化法检测大鼠脑皮质BDNF、ICAM1、VCAM1的表达。结果化合物971410、20、40mg·kg-1组能明显缩短定位航行试验中d2、d3的逃避潜伏期,提高空间搜索试验中原平台象限游泳距离占总距离的百分比(P<0.05,P<0.01);20、40mg·kg-1组能明显增加模型动物脑皮质BDNF的表达,降低脑皮质ICAM1的表达(P<0.05,P<0.01)。结论化合物9714能提高拟VD大鼠的学习记忆能力,同时对缺血后的神经元损伤、炎性损伤具有一定的保护作用。

重楼中甾体皂苷的分离与结构鉴定

目的分离、鉴定云南重楼ParispolyphyllaSmithvar .yunnanensis(Franch)HandMazz根茎中的甾体皂苷类化合物。方法采用乙醇提取、水饱和正丁醇萃取、硅胶柱色谱及高效液相色谱等方法进行分离 ,得到 5个化合物 ,通过FAB MS、1H NMR、13 C NMR、1H 1HCOSY、13 C 1HCOSY、HMBC、NOESY和TOCSY鉴定其化学结构。结果分离鉴定了 5种甾体皂苷 :薯蓣皂苷元 3 O {α L 鼠李吡喃糖基 (1→ 4 ) α L 鼠李吡喃糖基(1→ 4 ) [α L 鼠李吡喃糖基 (1→ 2 ) ]} β D 葡萄吡喃糖苷 (皂苷Pb ,Ⅰ )、纤细薯蓣皂苷 (Ⅱ )、皂苷Pa(Ⅲ )、薯蓣次苷A(Ⅳ )、pennogenindiglycoside(Ⅴ )。 结论化合物Ⅰ～Ⅴ均为已知甾体皂苷 ,纠正了已有文献中皂苷Pb(Ⅰ )核磁数据中的错误 ,提供了完整的NMR数据。

新月弯孢霉对重楼皂苷的生物转化

目的寻找选择性水解甾体皂苷C-3位糖链末端糖基的微生物,同时制备甾体皂苷的去糖基衍生物。方法利用新月弯孢霉(3.438 1)培养,对C-3位有双糖基结构的甾体皂苷类化合物重楼皂苷Ⅴ(化合物Ⅰ)、重楼皂苷Ⅵ(化合物Ⅱ)进行生物转化;用反相C18开放柱进行转化产物的分离纯化,波谱方法鉴定其结构。结果新月弯孢霉(3.438 1)均能将化合物Ⅰ和化合物ⅡC-3位糖链末端的鼠李糖水解,转化为单糖基皂苷,转化产物分别鉴定为薯蓣皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,即延龄草苷(trillin,化合物Ⅲ)和偏诺皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物Ⅳ)。结论首次发现新月弯孢霉(3.438 1)对重楼皂苷Ⅴ和重楼皂苷ⅥC-3位糖链的末端鼠李糖具有较强的水解能力。

穿山龙中甾体皂苷的分离鉴定

目的分离、鉴定穿山龙即穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)根茎中的甾体皂苷类化合物。方法采用溶剂提取、硅胶柱色谱及制备高效液相色谱等方法进行分离,通过化学和光谱学方法鉴定化合物的结构。结果分离得到4种甾体皂苷类化合物,其化学结构分别鉴定为:薯蓣皂苷(Ⅰ),纤细薯蓣皂苷(Ⅱ),26-O-β-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羟基-呋甾-△^(5(6))-烯- 3β,26-二羟基-3-O-{[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-α-L-吡喃鼠李糖基(1→4)}-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅲ),26-O-β-D-吡喃葡萄糖基25(R)-22-羟基-呋甾-△^(5(6))-烯-3β,26-二羟基-3-O-{[α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖基(1→3)}-β-D-吡喃葡萄糖苷(Ⅳ)。结论化合物Ⅲ,Ⅳ为首次从穿龙薯蓣中分离得到的呋喃甾烷型皂苷。

放射性肺纤维化大鼠动物模型的建立及其病变规律

用 60 Coγ射线对二级雌性 Wistar大鼠 (体重 ( 2 2 0± 2 0 ) g) 2 2 3只进行 30 Gy全胸单次照射 ,其中照射野为 4 .5cm× 4 .0 cm,照距为 3m,剂量率为 2 .7Gy/ min。分别于照后 3、7、1 4、2 1、2 8、4 2、56、70、90、1 80、2 70、36 5d共 1 2个时间点进行了取材观察。结果表明 ,肺脏病变初期呈急性变化 ,以后转为亚急性或慢性进行性发展过程 ,可大致分为 2个阶段 4个期。早期即急性炎症期或渗出期 ,中期为增生期 ,这 2期合为疾病的第 1阶段 ,称为放射性肺炎。后期即纤维化期 ,晚期即胶原化期 ,这 2期共同构成本病的第 2个阶段 。

知母中的两种新呋甾皂苷

目的研究知母根茎的化学成分。方法采用水煎提取、大孔吸附树脂SP825柱色谱、反相C18柱色谱等进行分离,并通过化学手段和光谱分析(FAB-MS,1HNMR,13CNMR,1H-1HCOSY)鉴定其化学结构。结果从知母根茎中分离得到6种甾体皂苷,分别鉴定为:(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷N,1),知母皂苷E1(2),(25S)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-甲氧基-5β-呋甾-2β,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-β-D-吡喃半乳糖苷(知母皂苷O,3),知母皂苷E2(4),(25R)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-22-羟基-5α-呋甾-2α,3β,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷(purpureagitosid,5),marcogenin-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-galactopyranoside(6)。结论化合物1和3为新化合物,命名为知母皂苷N和知母皂苷O,化合物5为首次从知母中分离得到。

小鼠脾淋巴细胞辐射死亡与凋亡之间的关系

探讨细胞凋亡在小鼠脾脏辐射损伤与重建中的作用及其机制，为急性放射病的防治提供依据。用原位末端标记、ＤＮＡ电泳和免疫组化技术观察经２～８Ｇｙ不同剂量γ射线整体照射后，小鼠脾脏淋巴细胞凋亡的动态变化过程和Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２蛋白在其中的作用。结果表明，（１）照射后早期淋巴细胞凋亡率迅速增加，如６Ｇｙ照射后４ｈ和１ｄ凋亡率分别为对照值的４９和９７倍；凋亡率还随照射剂量的增加而迅速升高，照射后８ｈ当照射剂量为２、４、６、８Ｇｙ时，凋亡率分别为对照值的３７、５４、６２和８３倍。（２）透射电镜观察表明，６Ｇｙγ－线照射后，小鼠脾脏淋巴细胞出现早、中、晚期典型凋亡细胞的形态学特征。ＤＮＡ凝胶电泳显示６Ｇｙ照射后４和６ｈ，脾脏淋巴细胞出现特征的ＤＮＡ梯形谱；末端标记法显示６Ｇｙ照射后４ｈ凋亡率约为照前值的３４倍。（３）照射后Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２蛋白的异常表达证实两者在淋巴细胞凋亡的调控中起重要作用。细胞凋亡参与了小鼠脾脏辐射损伤与修复的全过程，Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２蛋白对淋巴细胞凋亡的调控起重要作用。

辐射引起的小鼠外周血淋巴细胞凋亡及其机理

用原位末端标记、ＤＮＡ电泳和免疫组化技术，观察了经２，４，６和８Ｇｙ不同剂量γ－射线照射后，小鼠外周血淋巴细胞的凋亡和与凋亡有关的Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２蛋白在其中的作用。结果表明：（１）在照射后早期（４ｈ～７ｄ），淋巴细胞凋亡率迅速增加，如２，４，６和８Ｇｙ照射后４ｈ，凋亡率分别为对照值的２．６，３．８，５．５和１０．４倍，显示出较好的剂量效应关系。（２）随着照射剂量的增加，淋巴细胞绝对数急剧降低，如２，４，６和８Ｇｙ照射后４ｈ，淋巴细胞的绝对数分别为对照值的８２％，６３％，４７％和２２％，与淋巴细胞凋亡呈相反趋势，提示凋亡可能是急性照射后淋巴细胞减少的主要原因之一。（３）ＤＮＡ凝胶电泳显示，６Ｇｙ照射后３ｄ，淋巴细胞出现特征性的梯形谱；末端标记法显示，６Ｇｙ照射后７ｄ，凋亡率达到峰值，为照前值的１６倍，这些结果与Ｍａｙ－Ｇｒｕｎｗａｌｄ－Ｇｉｅｍｓａ染色所得数据基本符合。（４）照射后Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２蛋白的异常表达证实，二者在淋巴细胞凋亡的调控中起重要作用。上述结果为阐明淋巴细胞辐射损伤与修复的机制，以及急性放射病的防治提供了重要的依据。

正常和放射复合伤口血管再生中VEGF基因的表达及其意义

目的研究ＶＥＧＦ 基因在正常和放射复合伤口愈合中的表达及意义，探讨其在血管再生中的作用。方法将４ ８ 只Ｗｉｓｔａ ｒ 二级大鼠背部皮肤造成圆形伤口后，以２５Ｇｙ ６０ Ｃｏ γ射线局部照射，于伤后２ 、５ 、１０ 、１５ 、２ １ 和２８ｄ 活杀取材，采用免疫组织化学、原位杂交和原位ＰＣ Ｒ 等方法，研究ＶＥＧＦ 基因的表达及意义。结果单纯创伤组于伤后２ｄ，新生血管内皮细胞浆内ＶＥＧＦ 的表达呈强阳性；５ ｄ 时毛细血管数明显增多，其内皮细胞胞浆内ＶＥＧＦ 表达呈阳性；而于１０ｄ后，ＶＥＧＦ 的表达逐渐减少。创伤＋照射组则于伤后５ｄ，ＶＥＧＦ 的表达在血管内皮细胞胞浆内呈弱阳性，１０ ｄ 时阳性，１５ ｄ 后则呈弱阳性。原位杂交显示，ＶＥＧＦｍＲＮＡ 于单纯创伤组伤后２ ～５ ｄ 及创伤＋照射组伤后５ ～１０ｄ，血管内皮细胞浆内阳性。原位反转录ＰＣ Ｒ 则显示，ＶＥＧＦｍＲＮ Ａ 于单纯创伤组伤后２ ～１５ｄ 及创伤＋照射组伤后５ ～２８ｄ，呈阳性反应。结论内源性ＶＥＧＦ 基因的表达参与创伤愈合中血管再生过程。辐射使血管内皮细胞中ＶＥＧＦ 的表达减少。原位反转录ＰＣ Ｒ 方法较原位杂交能客观地反映内源性ＶＥＧＦ 基因的表达情况。

知母有效成分体内外给药对血小板聚集的抑制作用

目的研究知母有效成分(化合物9714)对血小板聚集性的影响。方法采用比浊法测定血小板聚集功能。结果化合物9714代谢产物10-3、10-4、10-5、10-6mol·L-1体外呈浓度依赖性抑制二磷酸腺苷(ADP)、胶原诱导的家兔血小板聚集(P<0.05,P<0.01);化合物971410、20、40mg·kg-1体内(ig)明显抑制ADP、胶原诱导的大鼠血小板聚集,5～7d给药效果较好(P<0.05,P<0.01)。结论化合物9714代谢产物对血小板聚集具有明显的抑制作用。

外源性bFGF对放射复合创伤伤口愈合的促进作用

采用宏观、光镜、免疫组化（显示Ⅲ型胶原）和原位杂交（检测Ⅰ、Ⅲ型胶原ｍＲＮＡ）等方法，动态观察外用ｂＦＧＦ对大鼠放射复合创伤伤口愈合过程的影响。结果显示：外用ｒｈｂＦＧＦ对放射复合创伤（于伤后即刻行１５Ｇｙ局部照射）伤口愈合有一定的促进作用。表现为：①ｂＦＧＦ可促进放射复合伤口内肉芽组织的形成，伤后７天见ｂＦＧＦ用药创面肉芽组织含量较对照创面明显增多；②ｂＦＧＦ可促进血管生成，伤后７天见ｂＦＧＦ用药创面肉芽组织中较对照创面有明显增多的新生毛细血管网；③应用ｂＦＧＦ可间接增加Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成和分泌；④ｂＦＧＦ可促进表皮重建，用药创面较对照创面提前约２天愈合。

Parisaponin Ⅰ和Parisvietnaside A的NMR数据分析

从滇重楼中分离得到2个甾体皂苷,利用1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、1D和2D TOCSY等多种核磁共振方法鉴定其结构分别为(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,22α,26-三羟基-呋甾-5-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-呋喃阿拉伯糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(1,Parisaponin I)和(25R)-3β,5α,6β-三羟基-△7-螺甾烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(2,paris-vietnaside A).对化合物1和2的1H NMR和13C NMR信号分别进行了归属和详细分析,并纠正了文献中的核磁数据归属错误.化合物2为首次从滇重楼中分离得到.

蒺藜全草中甾体皂苷类化学成分研究

[目的]对蒺藜全草化学成分进行研究。[方法]采用大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、ODS柱色谱及制备高效液相色谱法(PHPLC)对蒺藜70%乙醇提取液进行分离纯化,并利用理化数据测定和光谱数据分析等方法对所得单体进行了结构鉴定。[结果]分离鉴定了5个甾体皂苷:1)uttroside B;2)polianthoside D;3)替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡糖基(1→4)-[α-L-鼠李糖基(1→2)]-β-D-吡喃半乳糖苷;4)(25R)-26-O-β-D-吡喃葡糖基-5α-呋甾-3β,22α,26-三醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1→4)-吡喃半乳糖苷;5)海柯皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-[β-D-吡喃木糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷。[结论]化合物1和2为首次从蒺藜中分离获得。

皂苷Tb 2个糖基化产物的NMR研究

利用1 H NMR、13 C NMR、COSY、HSQC和HMBC等多种核磁共振技术,结合MS技术,确认了皂苷Tb的2个糖基化产物的结构,即偏诺皂苷元-3-O-α-D-葡萄糖-(1→3)-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(1)和偏诺皂苷元-3-O-α-D-葡萄糖-(1→4)-α-D-葡萄糖-(1→3)-[α-L-鼠李糖-(1→2)]-β-D-葡萄糖苷(2).化合物1和2为新化合物,对其1 H NMR和13 CNMR信号分别进行了全归属和详细分析.

肝素对成纤维细胞促增殖作用的研究

应用核仁组成区相关嗜银蛋白（ＡｇＮＯＲｓ）染色和抗Ⅲ型胶原以及抗５－溴脱氧尿苷单抗免疫组化技术，观察了肝素对体外培养的ＮＩＨ／３Ｔ３成纤维细胞增殖的影响，发现：（１）肝素能促使成纤维细胞数量增加，如０．１ｍｇ／Ｌ浓度的肝素在培养第３天成纤维细胞数量相当于对照值的１．３倍；（２）对成纤维细胞ＡｇＮＯＲｓ的合成显示出明显的促进作用，如０．２ｍｇ／Ｌ浓度的肝素培养第３天，其ＡｇＮＯＲｓ数量为对照值的２．７倍；（３）进一步分析肝素对成纤维细胞ＤＮＡ和Ⅲ型胶原合成的影响，结果表明，加入０．２ｍｇ／Ｌ肝素培养第３天，Ｓ期成纤维细胞和Ⅲ型胶原阳性细胞数分别为对照值的２．７倍和１．８倍。

胡芦巴来源的甾体皂苷研究进展

中药胡芦巴是豆科一年生草本植物胡芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)的干燥种子,富含甾体皂苷。本实验室对胡芦巴中甾体皂苷进行了系统研究,包括原生呋甾皂苷及其酶解产物的分离鉴定、利用液质联用技术对甾体皂苷类成分的快速表征与结构分析,以及利用超临界流体色谱技术对螺甾皂苷C-25R/S异构体的分析、制备分离等。本文对本实验室相关研究进行总结,以期有助于胡芦巴的开发与利用,也为今后中药的化学成分研究工作提供借鉴。

c-myc基因在辐射诱导骨髓细胞凋亡和修复中表达及意义

迄今,c-myc基因表达在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及修复中变化和意义于国内外同类文献尚未见到。本实验采用78只LACA小鼠,经γ射线全身照射,于照后4周内分批活杀,将骨髓组织石蜡包埋制片,H-E染色和制作电镜标本进行电镜观察,并将骨髓细胞涂片采用LSAB免疫细胞化学染色,动态观察c-myc蛋白在辐射诱导骨髓造血细胞凋亡及修复中变化。结果表明:照后小鼠骨髓出现明显损伤及损伤后重建现象。照后6小时,骨髓中凋亡的造血细胞明显增多,形态上表现为核染色质浓缩、边移,呈半月形、环状、戒指状或不规则状,并见凋亡小体。c-myc蛋白于照后6小时明显增多,位于造血细胞核内,而照后1-6天,其表达则进行性减少,至照后10-15天,c-myc蛋白再度增多,于照后21天后,c-myc表达趋于正常水平。因此,c-myc基因在辐射诱导的骨髓造血细胞凋亡及凋亡后的修复中表达均明显增多,可能参与了辐射诱导的造血细胞凋亡及修复过程。