枯草芽胞杆菌XF-1粗蛋白抑菌活性初步研究

枯草芽胞杆菌XF-1是一株对大白菜根肿病有良好防治效果及对多种植物病原真菌有抑菌效果的生防菌株。为了研究其可能的作用机制,本文用硫酸铵沉淀法提取了发酵液中粗蛋白,并在不同处理条件下对其抑菌活性进行了初步研究。该粗蛋白对蛋白酶K和胰蛋白酶及紫外照射均不敏感,对热稳定。经40、60、80℃和100℃处理20 min后,其抑菌作用基本上无变化;经121℃处理20 min后,抑菌活性保持60%。这些结果,为进一步研究XF-1菌株对根肿病的防治机制和进一步应用提供了试验依据。

海南蔗区甘蔗病害种类及发生情况

通过1年来对海南甘蔗产区8个县(市)28个乡镇进行病害调查,初步明确了海南甘蔗病害种类。共发现病害31种,其中由病原真菌引起的病害有19种,由病原细菌引起的病害有3种,由病毒引起的病害2种和由线虫引起的病害3种及由于甘蔗生长期出现的缺氮、缺磷、缺钾、缺钙等生理性病害4种。在这些病害中,甘蔗黑穗病(Ustilago scitaminea Sydow.)、赤腐病(Colletotrichum fuleatum Went.)、黄斑病(Mycovellosiella koepkei(Kruger)Deighton.)、轮斑病(Leptosphaeria sacchari Breda de Haan)、梢腐病(Gibberella fujikuroi(Sawada)Wollenw)、宿根矮化病(Clavibacter xyli subsp.xyli Davis)和甘蔗黄叶病(Sugarcane yellow-leaf virus,SCYLV)、花叶病(Sugarcane mosaic virus,SCMV)最为普遍,而对甘蔗生产产生主要影响的是甘蔗黑穗病和甘蔗花叶病。总结甘蔗苗期、生长中期及后期发生的各类主要病害,对指导海南蔗区甘蔗生产具有重要的意义。

生防菌株XF-1的鉴定和抑菌谱的测定

依据传统形态学、生理生化特征及16S rRNA基因序列,将一株对十字花科根肿病有很好防治效果的菌株XF-1鉴定为枯草芽孢杆菌。采用细菌的通用引物P0,P6扩增16S rRNA基因片段,得到1513 bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌的序列的同源性高达99%。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株能对供试的卵菌、子囊菌、担子菌和半知菌的21个植物病原真菌均有很好的抑制作用。

海南蔗区甘蔗黄叶病与花叶病发生情况的分子鉴定

于2010年甘蔗生长季节,对海南甘蔗产区8个县(市)24个乡镇进行甘蔗病毒病的调查和检测,初步明确海南蔗区甘蔗病毒病种类主要有2种,即由甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的甘蔗黄叶病和由高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)引起的甘蔗花叶病。其中甘蔗黄叶病最为普遍,检出率达到75%,可能是影响海南蔗区甘蔗产量的重要因素之一,而由高粱花叶病毒引起的甘蔗花叶病次之。同时针对甘蔗病毒病提出推广甘蔗脱毒健康种苗是其防治的主要措施,对指导海南蔗区乃至全国甘蔗生产具有重要的意义。

海南蔗区甘蔗害虫发生情况及防治对策

通过一年对海南甘蔗产区9个县(市)30个乡镇进行害虫调查,发现海南甘蔗害虫共有7目36科58种,其中蜚蠊目1科1种,等翅目1科1种,直翅目5科12种,缨翅目1科1种,半翅目11科14种,鞘翅目8科14种,鳞翅目9科15种。木蠹蛾、条螟、蔗根锯天牛、蔗根象、红尾白螟和异岐蔗蝗对海南甘蔗生产具有潜在威胁的害虫种类。总结了甘蔗苗期、生长中期及后期对各类害虫的防治对策,对指导海南蔗区甘蔗生产具有重要意义。

海南蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种鉴定

采集海南蔗区8个县市24个乡镇的甘蔗黑穗病菌样品24份,通过甘蔗黑穗病菌鉴别寄主NCO376(免疫)、NCO310(抗小种2,感小种1)、F134(感小种2,抗小种1)、F173(高感)及主栽品种ROC22,确定海南蔗区甘蔗黑穗病菌的生理小种。接种甘蔗黑穗病菌后1 a新植,2 a宿根的发病情况表明:海南蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种为小种2,或优势小种为小种2。这对了解海南蔗区甘蔗黑穗病菌生理小种的分化及分布情况,以及对今后海南蔗区甘蔗黑穗病的防控及抗黑穗病甘蔗种质的选育提供依据。

甘蔗黑穗病菌拮抗菌HAS的筛选和鉴定

采用传统形态学鉴定及16S rRNA基因序列分析,筛选鉴定对甘蔗黑穗病菌具有拮抗作用的细菌的归属,并采用细菌的通用引物P0、P6扩增16S rRNA基因片段。结果表明:得到1 533 bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌序列的同源性高达99%。其形态学特征:菌体为短杆状,能运动;革兰氏阳性反应;3%KOH溶解性实验呈阴性反应;有鞭毛,鞭毛周生;芽孢中生,椭圆形,孢囊稍膨大,初步将该菌株归属为枯草芽孢杆菌。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌对引起甘蔗和其它作物病害的多个植物病原真菌均具有很好的抑制作用。据此,可将分离的菌株HAS确定为对甘蔗黑穗病菌有较好防治效果的枯草芽孢杆菌。

微生物几丁质酶研究进展

简述了几丁质酶的研究历史,介绍了产几丁质酶的微生物种类、微生物几丁质酶的性质、基因克隆以及在生物防治领域中的应用。

枯草芽孢杆菌HAS中TasA基因的克隆与分析

为弄清枯草芽孢杆菌HAS对甘蔗黑穗病菌的抑制作用机理,选取可对多种植物病原真菌有抑制作用的抗菌蛋白TasA基因进行克隆与分析。结果表明:在HAS菌株中含有TasA基因,克隆编码抗菌蛋白TasA的基因全长,序列分析其有786个碱基组成,该序列与GenBank上登录的TasA(AJ871386.1)序列同源性达99%,推测蛋白分子量大小大约28KD,其中第104、164、169、250、399、623、627位等7个碱基发生碱基转换或颠换,而且这些变异分别发生在密码子的第2、2、3、1、3、2、3位碱基上,引起多肽链氨基酸的错义突变。经氨基酸序列比对,同Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168编码的TasA蛋白(NP_390342.1)在第150位和第209位上的氨基酸发生变化,由苏氨酸、天冬酰胺分别代替丙氨酸和谷氨酸。

23个甘蔗品种对甘蔗黑穗病的抗性测定

用混合冬孢子通过人工接种盆栽试验和大田自然发病的方法,对国家甘蔗品种区试中的21个品种及ROC16、ROC22号进行甘蔗黑穗病抗性鉴定。结果表明,人工接种抗病性表现较好的品种是云蔗99-596、粤甘42、桂糖29和福农39,达到高抗和抗病等级。在田间自然发病检测中,除了品种云蔗03-103、柳城03-1137和对照ROC22外,大部分品种在新植和宿根中都表现出了较好的抗黑穗病特性。为海南蔗区甘蔗生产和品种布局提供了科学试验依据。

枯草芽孢杆菌HAS中几丁质酶基因的克隆分析

为揭示枯草芽孢杆菌菌株HAS对甘蔗黑穗病菌抑制作用的机理,选取对多种病原真菌有抑制作用的几丁质酶进行克隆与分析。结果表明:菌株HAS基因组中含有1个ORF全长834bp的几丁质酶编码序列,其具有编码278个氨基酸的几丁质酶蛋白,该序列同GenBank上登录的几丁质酶蛋白(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)(ref|NP_390566.1)的同源性最高,达98%。推测该几丁质酶在菌株HAS抑制甘蔗黑穗病菌过程中可能起关键作用。

甘蔗黑穗病的研究

介绍了甘蔗黑穗病的病原及特征、侵染循环、发生规律和危害症状,提出了以种植抗病品种为基础,加强栽培管理,提高抗病能力,辅以药剂保护的综合防治方法。为减轻黑穗病的危害,提高甘蔗的产量和品质提供一定的依据。

板蓝根新病害——根肿病

在板蓝根种植园中观察到板蓝根的根肿病,为了确认、识别板蓝根的根肿病,采用人工接种的方法,证明根肿病菌可引起板蓝根的根肿病,并描述了根肿病在板蓝根上的症状。

不同生理状态云南松木段挥发物化学成分比较

采用顶空吸附法对健康松、衰弱松、枯死松的木段进行挥发性物质收集。通过GC-MS联用技术和计算机信息检索法对3种生理状态下松树木段挥发物化学成分进行了分离鉴定,用离子流峰面积归一法通过化学工作站数据处理系统确定了各成分的相对体积分数。比较结果表明:云南松在衰败过程中木段挥发性成分及相对体积分数发生了显著变化,主要化合物成分α-蒎烯、β-蒎烯相对体积分数减少;莰烯、月桂烯、3-蒈烯、柠檬烯、异松油烯、β-松油醇、1,4-二甲基-2-异丁基苯相对体积分数均有不同程度增加;马鞭草烯、2-甲基茚、1,4-二甲基金刚烷、马鞭草烯酮等化合物存在于衰弱木段和枯死木段中,且相对体积分数呈现上升趋势;α-松油醇、γ-松油醇、L-香芹酮仅存在于衰弱木段中;罗勒烯、反式松香芹醇、蒎莰酮、α-柏木烯、双环大香叶烯等12种挥发物成分仅出现于枯死木段中。

具有生物熏蒸能力的几种植物材料的筛选

选用棉花枯萎菌、黄瓜腐霉菌和白菜根系非致病镰刀菌作为指示菌株,在马铃薯蔗糖琼脂培养基上测定芥蓝(Brassica alboglabra L. H. Bailey)、结球甘蓝(B. oleraceavar. capitata)、白花椰菜(B. oleracea L. var. botry-tisL)、球茎甘蓝(B. oleracea var. gongylodes)、苦菜[B. integrifolia (West) O.E.Schulz]、芹菜(Apium graveolens L.)、黄瓜(Cucumis sativus L.)和大葱(Allium fistulosum L.)的生物熏蒸能力。结果表明,不同材料的组织捣碎粉末对3种菌均具有抑制作用,其中芸苔属植物的熏蒸抑菌效果好于非芸苔属植物,球茎甘蓝熏蒸效果较稳定,且效果最好,在第7 d对棉花枯萎病菌的抑制效果仍然达91.9%;但各植物抑菌效果均随着培养时间的延长而逐渐下降。

抗除草剂bar基因与EPSPS基因在转基因甘蔗中的应用研究

通过农杆菌介导法,分别将bar基因和EPSPS基因导入到甘蔗中,分别获得了抗草铵膦和草甘膦两种除草剂的转基因甘蔗。通过直接喷洒田间施用浓度的草铵膦和草甘膦除草剂,证明了转基因甘蔗T0、T1代、宿根1代和宿根2代外源基因遗传稳定,且均具有稳定的耐除草剂的功能。因此转耐除草剂基因的甘蔗,可以与转耐除草剂基因的玉米、大豆、油菜和棉花一样,有广阔的应用前景。

甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT4基因克隆及表达分析

采用RACE技术从甘蔗体内克隆出一个新型蔗糖转运蛋白基因,命名为ShSUT4(GenBank登录号为GQ485583.1),预测其编码501个氨基酸,存在GPH(蔗糖/H+共转运体)超家族保守结构域,具有12跨膜结构。初步研究结果表明,ShSUT4在甘蔗根茎叶中均有表达;且在9个不同甘蔗品种成熟茎中表达量存在差异,在其中8个品种中ShSUT4表达量的高低与所测茎节中锤度高低呈正相关性,推测ShSUT4可能参与调控甘蔗体内蔗糖的积累。

海南蔗区趋光性昆虫种类及其动态研究

采用太阳能杀虫灯连续2a对儋州、临高蔗区进行了诱捕试验.结果表明,海南蔗区趋光性昆虫共有10目27科45种,主要为鳞翅目（5科14种）和鞘翅目（11科20种）,分别占诱捕虫量的50.82％、17.74％.甘蔗害虫6目17科34种、天敌昆虫6目10科11种,分别占诱捕虫量的97.74％、2.26％,益害比1：44.大部分昆虫趋光高峰呈现在19：00～23：00.主要害虫发生峰期出现于4～10月,6月左右种群数量最为丰富,年发生规律显示天敌种群密度随害虫数量增多而加大.

感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高粱花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验。采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA。经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒。经检测构建的文库容量为1.6×106cfu,文库滴度2.2×106cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96%。结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础。

甘蔗黄叶病毒CP蛋白基因ihpRNA表达载体构建及烟草转化

为提高甘蔗抗病性,本研究根据甘蔗黄叶病毒海南分离物ScYLV-CHN-HN1全基因组序列(GenBank no.HQ342888),利用病毒CP蛋白介导的RNAi技术,针对病毒外壳蛋白CP,设计两对含有酶切位点的特异性引物,CPsf1/CPsr1和CPasf1/CPasr1,以构建好的pMD19-T/CP质粒为模板,pRNAi1017为中间载体,分别合成构建干扰载体的正反向片段pRNAi-CP-F-R,将CP正反向片段分别插入表达载体pCAMBIA2300的相应位置,构建含有发卡结构的RNAi载体p2300-CP-F-R,经过PstⅠ酶切鉴定,证明载体构建成功。通过农杆菌介导的方法,以干扰表达载体p2300-CP-F-R转化烟草,经过PCR检测,得到12株阳性转基因植株,Southern blot杂交和半定量RT-PCR对其检测,证明干扰片段已经整合烟草基因组中并进行了转录,该结果为RNAi介导抗病毒甘蔗育种研究奠定基础。