利用反式剪接核酶修复突变绿色荧光蛋白mRNA

为构建修复突变绿色荧光蛋白(GFP)基因的反式剪接核酶,分别构建包含突变的GFP基因的XYQ5/10-pGEM重组质粒、XYQ5/10-pEGFP-C2重组质粒及用于修复该突变基因的反式剪接核酶载体trans-rib-CMV2。通过对体外共转录XYQ5/10-pGEM和trans-rib-CMV2重组质粒的RNA产物进行RT-PCR检测核酶细胞外剪接效果;通过XYQ5/10-pEGFP-C2和trans-rib-CMV2重组质粒共转染HeLa细胞检测核酶细胞内的剪接效果。结果显示,XYQ5/10-pGEM、XYQ5/10-pEGFP-C2及trans-rib-CMV2重组质粒构建成功,反式剪接核酶在细胞外及细胞内都可以修复突变基因。虽然效率不高,但为今后更大规模地研究设计反式剪接核酶打下了基础。

截短绿色荧光蛋白突变体反式剪接修复核酶

Ⅰ型内含子核酶经过设计特定的信号引导序列(IGS),可特异性地定点剪接目的基因RNA,从而在RNA水平达到修复病变基因的目的。以四膜虫材料,克隆了其26SrRNA内含子核酶基因,体外转录证实该I型内含子核酶具有完全的自我剪接的功能。为检测该核酶的反式剪接功能,构建了缺失后半段564bp基因序列的绿色荧光蛋白(GFP)的截短突变体重组质粒XYQ5XYQ10pEGFPC2,并证实其失去了发射绿色荧光的活性。利用PCR和分子克隆技术,构建了以上EGFP突变体的反式剪接修复核酶ptransribCMV2,该核酶载体以克隆的26SRNA内含子为核心,选择EGFP编码区194位TG为剪接位点,以188193位设计IGS序列,核酶3′端携带195890bp的EGFP基因序列,连接于pRCCMV2真核表达载体中。体外转录突变EGFP的原核表达载体XYQ510pGEM和ptransribCMV2,以混合转录产物为模板进行RTPCR,电泳及测序证实产物中含有反式剪接修复的野生型EGFPmRNA,从而证实构建的反式剪接核酶具有体外反式剪接功能。将截短突变重组质粒XYQ5XYQ10pEGFPC2与核酶质粒ptransribCMV2共转染Hela细胞,用荧光显微镜观察转染结果,发现有少量共转染的Hela细胞发出绿光;RTPCR检测出野生型EGFPmRNA,证明构建的反式剪接核酶具有体内反式剪接的功能,但其反式剪接效率低。

定点诱变自我剪接Ⅰ型内含子核酶

目的验证嗜热四膜虫核酶自我剪接功能,定点诱变Ⅰ型内含子核酶及检测其自我剪接功能。方法PCR扩增嗜热四膜虫核酶基因连入pGEM-T载体,通过重组PCR获得3个非发夹区域定点诱变的Ⅰ型内含子核酶基因,连入pGEM-T载体,分别进行体外转录。结果嗜热四膜虫核酶及诱变的3个核酶自我剪接功能完全。结论非发夹区诱变的核酶不改变其自我剪接的功能,为以后反式剪接核酶的设计构建提供了更多的选择基础。

阿司匹林抑制核因子-κB增强索拉非尼对肝癌的促凋亡作用

目的观察合用阿司匹林（Aspirin）与索拉非尼（Sorafenib）对肝癌生长转移的抑制作用和促凋亡作用并探讨其机制。方法采用人肝癌裸鼠原位模型LCI-D20，分为对照组、Sorafenib单用组（30mg／kg灌胃，1d1次）、Sorafenib＋Aspirin合用组、Aspirin单用组（30mg／kg灌胃，1d1次），治疗4周后观察荷瘤小鼠生存期、肿瘤体积、肺转移，定量比较肿瘤细胞凋亡指数，观察各组荷瘤鼠生存期，检测各组核因子-κB（NF-κB）及IKBα表达。结果对照组、Sorafenib治疗组、Sorafenib＋Aspirin合用组、Aspirin治疗组肿瘤体积分别为（4．76±0．51）、（1．41-4-0．08）、（0．66±0．12）和（4．58±0．47）cm3；肺转移灶数目分别为（189±21）、（96±15）、（30±17）和（92±18）个；中位生存期分别为72、98、112、80d。肿瘤凋亡指数分别为（2．6±1．1）％、（8．6±3．7）％、（24．3±6．9）％和（6．8±1．5）％；与Sorafenib治疗组比较，Sorafenib＋Aspirin合用明显降低肿瘤体积（P〈0．05）、抑制肺转移灶数目（P〈0．01），延长荷瘤鼠生存期（P〈0．05）和促进肿瘤细胞凋亡（P〈0．05）。Sorafenib在肝癌中具有下调IKBcx和上调NF-κB—p65的作用而合用Aspirin可逆转此作用。结论Aspirin通过抑制NF．KB活化，进一步增强Sorafenib对肝癌凋亡的促进作用及对肝癌生长转移的抑制作用，并延长荷瘤鼠生存期。

Ⅰ型内含子核酶的研究进展

核酶具有特异识别和切割靶 RNA的特点 ,从而可以抑制一些特异基因产物的表达 ,而 型内含子核酶 ,不但具有剪切功能 ,而且可以进行顺式剪接及反式剪接。随着人们对 型内含子核酶的功能结构也有了进一步认识 ,相继用 型内含子核酶对 p5 3突变 m RNA及镰形红细胞贫血等遗传性疾病致病基因 m RNA的修复做了大量的研究 。

抗血管生成药治疗肝细胞癌的研究进展

肝细胞癌(HCC)是一种血管丰富的癌症,抗血管生成药可通过阻断血管生成因子,抑制内皮细胞扩增及预防细胞外基质和血管基底膜降解等机制而发挥治疗肝癌的作用,加上其临床相对优良的安全性可能为肝癌治疗提供了治疗新途径。

合用阿伐斯汀增强索拉非尼对肝癌生长转移的抑制作用

目的 观察合用阿伐斯汀（avastin）与索拉非尼（sorafenib）对人肝癌裸鼠模型的抑制效果.方法 采用人肝癌裸鼠原位模型LCI-D20,分为对照组、serafenib单用组（30mg/kg灌胃,1 d1次）、sorafenib与avastin合用组、avastin单用组（5 mg/kg腹腔注射,1周2次）,治疗4周后观察肿瘤体积、肺转移、血浆血管内皮生长因子（VEGF）,定量比较肿瘤微血管密度（MVD）和肿瘤血管内皮细胞凋亡指数,观察各组荷瘤鼠生存期.结果 对照组、sorafenib治疗组、mrafemb与avastin合用组、avastin治疗组肿瘤体积分别为（5.70±0.17）、（1.10±0.18）、（0.60±0.12）和（2.10±0.28）mm^3;肺转移灶数目分别为（191±23）、（98±18）、（31±19）和（98±20）个;血浆VEGF分别为（1689±612）、（3762±1195）、（1844±746）和（420±161）ng/L;中位生存期分别为70、87、112、80 d.4组肿瘤微血管密度分别为（3.77±0.44）%、（1.28±0.15）%、（0.56±0.08）%、（1.32±0.18）%;肿瘤血管内皮细胞凋亡指数分别为（12.6±1.8）%、（32.6±8.7）%、（54.3±11.9）%、（26.8±6.5）%;与sorafenib治疗组比较,avastin与sorafenib合用明显抑制血浆VEGF（P〈0.05）、降低肿瘤体积（P〈0.05）、抑制肺转移灶数目（P〈0.01）,延长荷瘤鼠生存期（P〈0.05）,降低肿瘤微血管密度（P〈0.05）和促进肿瘤血管内皮细胞凋亡（P〈0.05）.结论 sorafenib在肝癌裸鼠模型中上调血浆VEGF导致耐药,avastin下调VEGF,通过促进肿瘤血管内皮细胞凋亡和降低肿瘤微血管密度,进一步增强sorafenib对肝癌生长和转移的抑制作用,并延长荷瘤鼠生存期.