基于CRISPRi的贝氏柯克斯体dotB基因沉默

目的更简便快捷地研究贝氏柯克斯体基因功能。方法基于CRISPRi原理构建携带化脓链球菌dCas9的重组质粒,将靶向贝氏柯克斯体dotB基因的sgRNA序列插入重组质粒中并将质粒经电转化导入贝氏柯克斯体,利用脱水四环素(aTC)诱导dCas9表达以抑制贝氏柯克斯体dotB基因的转录,从而建立基于CRISPRi系统的贝氏柯克斯体基因沉默技术。结果在aTC诱导下,该CRISPRi系统中dCas9可正常表达,dotB在转录水平和蛋白水平均被抑制,dotB表达抑制后贝氏柯克斯体胞内生长繁殖水平降低。结论成功建立起基于CRISPRi的贝氏柯克斯体的基因沉默技术,为研究贝氏柯克斯体特定基因的生物学功能研究提供了技术支撑。

Q热疫苗研究

Q热(Q fever)为一种世界性分布的重要人兽共患病,疫苗接种是预防Q热的最有效手段。专性细胞内寄生的贝氏柯克斯体是Q热的病原体,灭活I相贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)免疫保护效能几乎为100%,但是其免疫副反应强。氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体(CMR)和三氯醋酸提取贝氏柯克斯体可溶性抗原(TCA)Q热疫苗保留灭活Q热疫苗的免疫保护效能,且免疫副反应显著减轻。但CMR和TCA Q热疫苗均需要用鸡胚大量培养贝氏柯克斯体,需要在高等级生物防护实验室采用复杂步骤提取、纯化贝氏柯克斯体,这些使Q热疫苗的生产成本高、批量生产难。近十年来,国内外Q热疫苗研究着力于分子疫苗,并已经由研究贝氏柯克斯体保护性抗原转移到筛选能诱导特异性细胞免疫应答的CD4+和CD8+T细胞表位上,以期望T细胞表位在机体内高效表达,诱导机体产生良好的抗Q热保护性免疫应答。

贝氏柯克斯体血清学反应蛋白芯片的研制

贝氏柯克斯体为Q热的病原菌。本研究对19个贝氏柯克斯体血清学反应阳性蛋白基因进行PCR扩增，将扩得的基因片段与表达载体连接，将重组质粒转化大肠杆菌并表达目的蛋白，采用Ni-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。将纯化的重组蛋白点在醛基化玻片上制备蛋白芯片。将贝氏柯克斯体新桥株实验感染小鼠血清分别对蛋白芯片进行血清学分析，结果显示能与贝氏柯克斯体感染1、2、3、4周小鼠血清反应的蛋白数分别是0、16、19和18个。结果说明该芯片上的重组蛋白具有贝氏柯克斯体感染血清反应特异性，该芯片分析有望用于Q热的血清学诊断。

我国斑点热立克次体感染与免疫的实验研究

研究证明黑龙江立克次体能够感染人血管内皮细胞和BALB/c小鼠,引起小鼠菌血症和器官损伤;全基因组序列分析发现黑龙江立克次体毒力相关基因。表面蛋白质组分析鉴定了黑龙江立克次体和立氏立克次体的表面蛋白,用表面蛋白免疫C3H/HeN小鼠,发现某些表面蛋白为保护性抗原,并揭示这些保护性抗原均能够诱导抗原特异CD4+和CD8+T细胞增殖并产生和分泌IFN-γ和/或TNF-α,以及诱导高水平特异性IgG2a产生,在这些免疫因素的协同作用下使小鼠有效抵抗立克次体感染。用黑龙江立克次体感染Tim-3高表达或低表达人血管内皮细胞以及Tim-3高表达转基因小鼠,结果有力证明Tim-3高表达能够促进人血管内皮细胞和小鼠抵抗黑龙江立克次体感染。

恙虫病实验室检测规范专家共识

恙虫病,又名丛林斑疹伤寒,是主要经恙螨幼虫叮咬传播,由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)感染引起的,并以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床特征的一种自然疫源性疾病,主要流行于东亚和东南亚地区。恙虫病的临床症状不典型,很容易被误诊和漏诊。中国医药生物技术协会生物诊断技术分会和中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会的专家学者参考国际相关指南,梳理国内外恙虫病精确、快速实验室检测相关进展,总结经验,形成了本共识。旨在明确实验室检测在恙虫病确诊方面的作用,为恙虫病的早期精准和快速实验室诊断提供支持,从而为临床医生及时使用有效抗生素干预治疗和预防并发症提供有益帮助。

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的安全性评价

目的评价采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗(CMRV)的安全性。方法分别用3批CMRV和灭活贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)致敏豚鼠,4w后用相同疫苗对致敏豚鼠作皮肤试验。结果CMRV致敏豚鼠与WCV致敏豚鼠的皮试点红肿大小在皮试后1～6d无显著差异,但是从第7d开始,差异显著。皮试后第14d采集接种部位组织做病理切片,WCV致敏豚鼠皮试点的表皮组织有局灶性变性、坏死,并见大量炎性细胞浸润。CMRV致敏豚鼠的皮试点组织基本正常,少数豚鼠偶见局灶性变性,但无坏死现象。3批CMRV致敏豚鼠皮试点组织病变程度相似,均显著轻于WCV致敏豚鼠。结论采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的免疫副作用显著轻于灭活Q热疫苗,具有更好的安全性。

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的免疫保护性评价

目的动物实验评价采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗(CMRV)的免疫保护性。方法将三批小量制备的CMRV和灭活贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)分别用1μg、10μg、100μg三个剂量皮下注射免疫BALB/c小鼠,4周后用初次免疫的一半剂量腹腔注射加强免疫1次,2周后用107的贝氏柯克斯体强毒株腹腔注射感染免疫小鼠,感染第7d活杀小鼠、摘取小鼠脾脏,用荧光定量PCR检测小鼠脾脏组织的贝氏柯克斯体。结果所有Q热疫苗免疫组的小鼠脾脏荷菌量均显著少于非免疫组,100μg免疫组的荷菌量显著低于10μg免疫组,10μg疫苗组显著低于1μg免疫组。每批CMRV免疫组与相同剂量WCV免疫组之间的贝氏柯克斯体含量无显著差异。结论国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗具有与灭活Q热疫苗一样良好的抗贝氏柯克斯体感染的免疫保护性。

贝氏柯克斯体重组膜蛋白抗原激活树突状细胞诱导特异性免疫应答

目的分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)膜蛋白抗原对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的激活作用,筛选能有效激活DCs的蛋白抗原,探讨该蛋白抗原间接激活T细胞的作用。方法从健康成年人外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DCs;分别用Cb的5种重组膜蛋白IcmO、EnhA、SecB、Lo1A、HspB刺激DCs;用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测刺激后DCs表面分子表达。结果 SecB刺激的DCs表达CD83,CD86,CD80,CD54,CD58,和CD40水平显著高于其它4种蛋白;将SecB激活DCs或SecB激活DCs培养上清刺激T淋巴细胞,FACS检测显示刺激后CD4+和CD8+细胞高水平表达的T淋巴细胞活化标志CD69以及细胞因子IFN-γ和TNF-α。结论 SecB膜蛋白抗原能有效激活DCs和它所激活DCs能够诱导特异性细胞免疫应答,为贝氏柯克斯体潜在保护性抗原。

苣荬菜乙醇提取液抗贝氏柯克斯体的初步研究

目的初步探讨苣荬菜（北败酱）乙醇提取物的抗Q热病原菌-贝氏柯克斯体药效。方法用乙醇提取苣荬菜,1g干生药获得1mL提取液;用贝氏柯克斯体腹腔感染Balb/c小鼠（105菌体/只）感染后第2d用倍比（5-160倍）稀释苣荬菜乙醇提取液腹腔给药,每天1次、连续给药5d;第7d处死小鼠并取小鼠脾脏组织提取DNA,用种特异性荧光定量PCR检测DNA。结果 10、20、40、80倍稀释药物组小鼠脾脏贝氏柯克斯体载量约2~5倍少于非药物处理对照组,其中20倍稀释药物组的小鼠脾脏贝氏柯克斯体载量显著（5倍）少于对照组。结论我们的研究首次证明苣荬菜乙醇提取物对贝氏柯克斯体体内生长有明显的抑制作用,提示它具有潜在的抗贝氏柯克斯体药效。

云南玉龙鼠类携带贝氏柯克斯体的基因分型研究

为更好地了解云南省鼠类中贝氏柯克斯体Coxiella burnetii的流行情况,以便制定针对Q热的预防和控制措施,本研究采用巢式PCR方法检测云南省玉龙县捕获的鼠类携带贝氏柯克斯体的情况,并对阳性样本的贝氏柯克斯体进行多间隔区序列分型(multispacer sequence typing,MST)和多位点可变数目的串联重复分析(multilocus variable number tandem repeats analysis,MLVA)。结果显示,在玉龙共捕获到49只野生鼠类,其中24只携带贝氏柯克斯体(48.98%,24/49)。基因分型结果显示阳性样本携带贝氏柯克斯体的MST型别可分为MST16和一种新的MST基因型别,但未能获得最终的MLVA基因型别。本研究表明云南玉龙的鼠类携带新的贝氏柯克斯体MST基因型别,可为我国Q热的溯源提供一定的理论依据和数据支撑。

贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

目的使用贝氏柯克斯体5种重组表面蛋白作为包被抗原的酶联免疫吸附试验用于血清学检测的特异性和敏感性分析。方法本研究建立由贝氏柯克斯体的Com1、GroEL、Mip、OmpH、RplL重组表面蛋白抗原分别包被的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,然后分别检测贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清和Q热患者血清中IgG特异性抗体。结果 8份贝氏柯克斯体感染小鼠血清中除1份血清与RplL反应为阴性外其它均为阳性;11份Q热患者血清中除1份血清与RplL、1份血清与OmpH反应为阴性外,其它血清反应均为阳性。将这5种重组蛋白分别与莫氏立克次体、黑龙江立克次体、恙虫病东方体实验感染小鼠血清反应,除1份黑龙江立克次体感染小鼠血清与GroEL反应为阳性外,其它血清反应均为阴性。另外,Com1对斑疹伤寒、斑点热、恙虫病患者血清的阳性反应率平均为22.2%,GroEL为25.0%,Mip为25.0%,OmpH为25.0%,RplL为13.9%。结论这些结果证明这5种重组蛋白抗原均可被贝氏柯克斯体感染血清所识别。所建立的ELISA方法具有良好特异性和敏感性,可用作Q热血清学诊断。

普氏立克次体重组表面蛋白制备和免疫印迹抗原特异性分析

目的克隆与表达普氏立克次体(Rickettesia prowazekii)主要蛋白抗原基因,分析所表达重组蛋白的抗原特异性。方法采用PCR法从普氏立克次体全基因组中扩增其主要抗原基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒;将基因重组表达质粒转化大肠杆菌,用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白。将普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、贝氏柯克斯体等实验感染小鼠血清与重组蛋白做免疫印迹。结果经过PCR扩增后获得9个目的基因片段,用其构建出9个原核表达质粒;9个原核表达质粒转化菌均高效表达出相应的重组蛋白;结果显示FtsZ、GroEL、Rp828、EF-Ts等4个蛋白特异性最好,仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应;其次是Omp,它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外,仅与莫氏立克次体感染血清反应。结论 FtsZ等4个重组蛋白为普氏立克次体的特异性抗原,可以作为研制流行性斑疹伤寒血清学诊断试剂的候选抗原。

黑龙江立克次体感染血管内皮细胞的初步研究

目的通过黑龙江立克次体感染体外培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)探讨其在内皮细胞内的生长规律。方法将泛影葡胺密度梯度超速离心纯化的黑龙江立克次体(HLJ-054株)感染体外培养的HUVEC,通过间接免疫荧光和扫描电镜检测与观察不同时相黑龙江立克次体在内皮细胞内的生长状况。热灭活黑龙江立克次体做平行对照。结果立克次体粘附并侵入内皮细胞,在感染后第6 h及第24 h分别为感染高峰;感染5 d后细胞内立克次体逐渐增殖,第8～9 d细胞内立克次体急剧增殖,并见细胞核内有少量立克次体,细胞出现病变,第12 d细胞内充满立克次体,大部分细胞皱缩脱落。结论黑龙江立克次体能够感染血管内皮细胞,在血管内皮细胞内不断增殖而使细胞死亡。

黑龙江立克次体外膜蛋白B基因表达及表达重组蛋白的抗原性分析

黑龙江立克次体为远东蜱传斑点热病原体,本文以黑龙江立克次体基因组为模板,扩增ompB的4段基因,利用原核表达载体构建重组表达质粒,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌表达重组目的蛋白,并对其抗原性进行分析.免疫印迹反应表明,重组表达的4个蛋白均与黑龙江立克次体感染小鼠血清反应.该4个重组蛋白分别免疫小鼠后,分析其血清的特异性结果显示,4个重组蛋白免疫血清,其特异性抗体效价均≥1：5 120,与斑点热群立氏立克次体有相对明显的血清学交叉反应（≥1：40）,而和斑疹伤寒群立克次体仅有轻度交叉反应（≤1：40）.结果表明,重组OmpB蛋白能有效诱导机体产生特异性体液免疫应答,并能与黑龙江立克次体抗体产生特异反应,显示其具有良好的抗原性.

水稻内生成团泛菌YS19共质体形成差异表达蛋白MalE及其兼职功能

成团泛菌YS19是从水稻"越富"品种中分离的一种优势内生细菌,与宿主水稻互作时具有多种促生作用,其形成的共质体(symplasmata)结构与菌体抗逆及与宿主互作有重要意义.研究发现了一种在YS19共质体形成阶段高表达的差异蛋白,对其用肽指纹图谱进行鉴定,发现其属于周质空间麦芽糖结合蛋白家族.克隆了该蛋白质的基因,重组表达并分离纯化了该蛋白质,发现它是一种兼职功能蛋白,其不仅参与麦芽糖的ABC运输系统,而且在强酸环境下不易发生变性沉淀,并可通过疏水面的显著暴露结合底物蛋白来发挥分子伴侣活性,这些兼职功能构成了菌体抗逆生存适应性的重要分子基础.

恙虫病东方体三种膜蛋白抗原包被酶联免疫吸附试验的特异性和敏感性分析

用恙虫病东方体的r47、 r56、 r58 kDa重组膜蛋白抗原包被建立酶联免疫吸附试验（ ELISA ），对恙虫病东方体实验感染小鼠血清和临床患者血清做IgG抗体检测。8份恙虫病感染小鼠血清中除1份血清与r58 kDa蛋白的反应阴性外其他反应均为阳性；而这3个重组蛋白与贝氏柯克斯体（ Q热病原体）、莫氏立克次体（地方性斑疹伤寒病原体）、黑龙江立克次体（远东斑点热病原体）感染小鼠血清反应均为阴性。另外，12份恙虫病患者血清对这3个蛋白的反应均有11份（92％）为阳性。另外， r47 kDa抗原对11份Q热患者血清、11份斑疹伤寒患者血清、13份斑点热患者血清的反应阳性率分别有27％、18％、23％，对r56 kDa抗原分别为27％、0％、8％，对r58 kDa抗原分别为18％、18％、23％。这些结果显示这3个重组蛋白抗原均有识别恙虫病东方体感染血清的良好特异性和敏感性，用这3种重组蛋白抗原建立的ELISA将为我国恙虫病血清学诊断提供新的实用方法。

加强我国Q热的防控

Q热是一种重要的人兽共患病,其病原体为贝氏柯克斯体,Q热自然疫源地在我国广泛分布。贝氏柯克斯体在蜱经期和经卵垂直传播,携带贝氏柯克斯体的蜱叮咬野生动物或家畜,引起动物感染;感染动物将贝氏柯克斯体大量排出污染环境,导致人Q热发生或暴发流行,因此,加强我国Q热的防控很有必要。

江西省啮齿动物携带立克次体分子流行病学研究

目的调查江西省部分县区啮齿动物携带的立克次体。方法在江西省南丰县、铜鼓县、上犹县、浮梁县、上高县、上饶市广信区捕获啮齿动物,运用形态学结合分子生物学方法鉴定其种类。采用巢式PCR方法检测捕获的啮齿动物的脾脏组织样本中的柯克斯体属、斑点热群、东方体属和无形体属立克次体。结果捕获啮齿动物6种共393只,包括黑线姬鼠、褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、社鼠和臭鼩鼱,黑线姬鼠为优势鼠种(311/393)。从19只黑线姬鼠检出柯克斯体(6.11%),从2只黑线姬鼠检出东方体(0.64%),从1只黑线姬鼠检出斑点热群立克次体(0.32%)。对扩增阳性基因片段测序和对获得基因序列做同源性比对,结果浮梁县黑线姬鼠检出新塔拉萨维奇立克次体、恙虫病东方体、贝氏柯克斯体;铜鼓县和上饶市广信区黑线姬鼠检出贝氏柯克斯体;南丰县黑线姬鼠检出恙虫病东方体。除黑线姬鼠外,其它5种啮齿动物均未检出立克次体。结论江西省部分地区的黑线姬鼠携带贝氏柯克斯体、新塔拉萨维奇立克次体、恙虫病东方体等立克次体病原体,人群存在相关立克次体感染的风险,疾控和医疗机构应加强立克次体病的监测。

布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043的功能和致病机制研究

目的研究布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043在布鲁氏菌感染和胞内生存过程中的作用。方法以羊种布鲁氏菌104株为起始菌株,通过同源重组的方法构建布鲁氏菌BPE043基因缺失株。将布鲁氏菌野生株104和突变株104ΔBPE043在相同的起始浓度下培养,观察它们生长变化的趋势;用野生株和突变株分别感染小鼠,构建小鼠体内感染模型,测定小鼠脾重并计算脾脏细菌载量;利用免疫共沉淀技术筛选BPE043蛋白的宿主互作蛋白。结果成功构建了布鲁氏菌BPE043基因缺失株。与野生株相比,突变株104ΔBPE043在体外培养的生长趋势和野生株基本相同;小鼠感染实验显示,在感染1周后,两组小鼠脾均肿大,但突变株104ΔBPE043感染组小鼠脾重低于野生株104感染组小鼠脾重;在感染后两周,两组小鼠脾肿大现象开始减轻。在细菌载量方面,在感染1周后,突变株104ΔBPE043感染小鼠的脾脏细菌载量低于野生株104感染小鼠;在感染后2周,突变株感染组的脾细菌载量下降趋势更明显。免疫共沉淀实验显示BPE043蛋白与鼠源小分子GTP结合蛋白Rab4和Rab11存在相互作用。结论布鲁氏菌IV型分泌系统效应蛋白BPE043是布鲁氏菌重要的毒力因子。本研究为进一步探索BPE043基因在布鲁氏菌感染和胞内生存中的作用奠定了基础。

膝骨性关节炎的现代针灸治疗研究进展分析

笔者通过回顾2006年—2016年公开发表的文献资料,对针刺在膝骨性关节炎中的临床应用、选穴等规律和特点进行了分析和总结。