开放式教学法在分子生物学教学中的实践

在分子生物学的教学过程中,我们以鼓励学生的创新能力,提高学生综合素质为目标,在教学资源、教学内容、教学评价、教学方法上尝试了开放式教学法,给学生提供更多的学习机会和环境,激发学生学习的热情,培养学生的自学能力、独立思考和解决问题的能力。

人参植物高质量RNA的分离及其皂苷生物合成相关新基因GBR6的表达分析

为从富含多糖的人参植物组织中分离出高质量的RNA,使用改进的两种异硫氰酸胍法,可从人参植物根组织中提取到较高产量和质量的总RNA。每克新鲜组织的RNA产量在80～110μg之间;经琼脂糖凝胶电泳分析,可见到28S和18SrRNA两条完整、清晰的条带;紫外分光光度法测得的A_(260)/A_(280)比值位于1.8～2.0。而且,使用该改良法分离的RNA,可广泛用于检测基因表达的RT-PCR与Northern印迹杂交分析以及cDNA文库构建等植物分子生物学研究。

东方田鼠胚胎成纤维细胞永生化细胞系的建立

目的建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系,为全面研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定基础和提供细胞实验材料。方法运用脂质体介导的基因转染法将pSV3neo质粒导入第3代东方田鼠胚胎成纤维细胞,经G418筛选抗性克隆并扩大培养,建立永生化细胞系;用PCR检测细胞株中SV40T基因的整合,RT-PCR鉴定SV40T基因在转染细胞中的表达;绘制东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞生长曲线。结果阳性细胞克隆已扩大培养并稳定传代50代,经鉴定SV40T抗原已整合到东方田鼠胚胎成纤维细胞中且稳定表达。结论成功建立东方田鼠胚胎成纤维永生化细胞系。

东方田鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及生物学特性

目的对影响东方田鼠胚胎成纤维细胞(MfEF)分离和培养的因素进行探索,并观察其生物学特性。方法取室内繁殖饲养不同胎龄的东方田鼠胚胎分离成纤维细胞,通过原代和继代培养,分析比较不同胎龄、不同血清浓度、不同胰蛋白酶浓度等因素对MfEF分离及培养的影响,观察MfEF的生长形态及其生物学特性。结果 MfEF为贴壁型生长,细胞形态多样,呈梭形、不规则多边形;采用0.125%的胰蛋白酶室温消化12～13 d胚胎组织5 min,以DMEM培养基添加15%小牛血清分离培养MfEF的效果最佳;MfEF2～7代增殖最旺盛。结论获得了实验室分离、培养MfEF的有效方法 ,为进一步深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制以及开展不同动物成纤维细胞间比较研究奠定了基础。

改进Dijkstra算法在校园电子地图系统中的应用

校园电子地图系统中具有自动寻路功能,结合电子地图数据特点,选择改进Dijkstra算法来实现。使用建立顶点对象数组的方法对Dijkstra算法加以改进,既节省内存空间,又提高了时间效率。在校园电子地图系统中的应用实践证明,改进Dijkstra算法适用于在数据规模与复杂度不高的图中解决最短路径求解问题。

不是所有的景区都适合做研学

当前,“研学”成为一个热词,各教育活动基地和景区景点也都一哄而上,开始推广这项活动。事实上,适合并能够做研学的景区景点要具备三个基础要件。一、优质的研学课程课程是研学高质量发展的生命线,也是研学的核心竞争力所在。怎样的研学课程是有效的呢?(一)课程资源是基础基地和景区景点的课程资源是否丰富完整,对研学来说非常重要。不是说有展馆、场地、简单的设施设备就可以,而是要看其空间大小、设计布局、内容呈现是否适合学生,是否有一定的系统性,是否有课程开发的价值,能否让学生通过参观浏览、实践操作、探索深思达到认知、思维、践行能力的提升或者情感的升华。

重组病毒rAAV2-MfE77.43转导小鼠对日本血吸虫攻击感染的抵抗作用

目的探讨东方田鼠(Microtus fortis)骨髓E77.43基因片段(Mf E77.43)对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)攻击感染的抵抗作用。方法将Mf E77.43构建至重组腺相关病毒(AAV2)载体上,磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞,纯化重组病毒rAAV2-Mf E77.43后,提取转染后细胞总RNA,RT-PCR检测E77.43基因表达情况,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析rAAV2-Mf E77.43纯度。将18只昆明小鼠随机分为3组,每组6只,实验组每鼠于第0、3、7天肌内注射生理盐水稀释5倍的rAAV2-Mf E77.43病毒液400μl,阴性对照组和空白对照分别注射等量p AAV空载体和生理盐水。每次注射前取小鼠尾静脉血,斑点ELISA法检测小鼠血浆中E77.43表达情况。末次注射后,用日本血吸虫尾蚴经小鼠腹部贴片进行攻击感染,40条/鼠。感染后第41天,剖杀小鼠,分别收集各组小鼠的肝脏和小鼠体内的血吸虫成虫,计数成虫数和每克肝脏虫卵数(LEPG),计算减虫率和减卵率,HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿病理特征。结果RT-PCR检测获得约330 bp的目的DNA片段。SDS-PAGE分析结果显示,重组病毒rAAV2-Mf E77.43外壳蛋白可见3条特征性蛋白条带,相对分子质量(Mr)分别为87 000、72 000、62 000,且杂带较少,病毒纯度较好。斑点ELISA法检测结果显示,小鼠注射rAAV2-Mf E77.43后第3天,血浆中E77.43蛋白开始表达,且稳定表达至第41天。实验组小鼠体内日本血吸虫成虫数和LEPG分别为20.16±3.93和19 800±2 715,均低于阴性对照组的29.16±2.44和28 000±2 192(P<0.01);实验组的减虫率和减卵率分别为27.3%和26.2%。HE染色可见,实验组小鼠肝脏虫卵周围嗜酸粒细胞和浸润炎性细胞较少,并以单个肉芽肿较为多见。结论东方田鼠E77.43基因对血吸虫感染具有一定的预防保护效果,提示E77.43基因可能参与东方田鼠天然抵抗日本血吸虫感染。

重组逆病毒pRevTRE-ETRE-E77.43转导小鼠后抗血吸虫感染作用

目的探讨东方田鼠E77.43基因片段治疗日本血吸虫感染的生物学功能。方法构建pRevTRE-E77.43重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞,用Hygromycin筛选后获得稳定表达的细胞株,并进行重组逆转录病毒的包装、浓缩与纯化。通过静脉或腹腔途径将制备的重组病毒注射到日本血吸虫感染模型小鼠体内,探讨目的基因在小鼠体内的表达以及体内治疗血吸虫感染的作用。结果病毒注射动物机体7 d后目的基因就有表达,且一直能持续表达45 d以上。pRevTRE-E77.43诱导小鼠产生了31.0%的减虫率,高于pRevTRE的1.2%(t=3.524,P<0.01);pRevTRE-E77.43诱导小鼠产生了35.0%的减卵率,高于pRevTRE的0.9%(t=9.485,P<0.01)。结论 pRevTRE-E77.43能对血吸虫感染模型小鼠产生一定程度的治疗效果,说明东方田鼠E77.43基因参与了东方田鼠抗日本血吸虫感染的生物学作用过程。

东方田鼠HSP90α和KPNA2基因表达及体内抗日本血吸虫效果比较观察

目的比较东方田鼠抗日本血吸虫基因HSP90α和KPNA2的表达差异及体内抗虫效果差异。方法RT-PCR扩增并比较健康东方田鼠新分离的心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、皮肤、骨髓组织中HSP90α和KPNA2的表达情况。40只雄性昆明小鼠随机分为空白对照组(DMEM培养基)、阴性对照组(pLXSN质粒转染病毒)、pLXSN-HSP90α组和pLXSN-KPNA2组等4组,每组10只,各组分别于第1、3、7 d每鼠尾静脉注射重组质粒转染病毒(2×10^6 cfu/ml)或培养基0.2 ml。注射后第2天,各组小鼠腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±2)尾/鼠。感染后第42天,剖杀小鼠,门脉灌注检获成虫,测量死亡后合抱及单性虫体长度,计算虫荷、减虫率、每克肝虫卵数(LEPG)、肝脏减卵率,HE染色观察肝脏病理变化,观察比较HSP90α和KPNA2对日本血吸虫感染小鼠的保护效果。结果RT-PCR结果显示,HSP90α在东方田鼠脑、骨髓中高表达,而KPNA2在心、肾和肌肉中高表达。体内实验结果显示,pLXSN-HSP90α组和pLXSN-KPNA2组小鼠的肝脏颜色分别呈灰黄色和灰黑色,虫荷分别为(11.3±1.1)、(11.6±1.3)条,血吸虫成虫体长分别为(1.19±0.04)、(1.21±0.05)cm,LEPG分别为1852.0±392.4、1035±485.4,与阴性对照组[(16.7±1.3)条、(1.39±0.06)cm、3644.0±523.6]比较差异均有统计学意义(P<0.05)。两个实验组的虫荷、成虫体长差异无统计学意义(P>0.05),而LEPG指标差异有统计学意义(P<0.05)。两组减虫率分别为40.8%和39.4%(P>0.05),肝减卵率分别为57.9%和76.5%(P<0.05),与阴性对照组(12.6%、17.3%)比较差异有统计学意义(P<0.01)。肝组织切片HE染色镜下观察显示,pLXSN-HSP90α组和pLXSN-KPNA2组小鼠的肝脏虫卵结节数量均远少于阴性对照。结论东方田鼠抗日本血吸虫基因HSP90α和KPNA2在脑、骨髓、心脏、肾脏和肌肉组织中表达存在差异;两者对日本血吸虫感染小鼠保护效果在减卵率和LEPG存在差异。

筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因ILKAP表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白

目的筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ILKAP)表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白。方法提取东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白,进行免疫共沉淀,实验组为东方田鼠骨髓蛋白+日本血吸虫童虫蛋白+ILKAP抗体+磁性珠子,阴性对照组以兔IgG抗体代替ILKAP抗体,阳性对照组为东方田鼠骨髓蛋白或日本血吸虫童虫蛋白。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免疫沉淀复合物进行分离,切取差异性蛋白条带通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDITOF-MS)鉴定,获得的混合物肽片段利用Mascot软件进行分析检索。分别以东方田鼠骨髓cDNA和日本血吸虫童虫c DNA为模板, RT-PCR扩增东方田鼠ILKAP (Mf ILKAP)基因和日本血吸虫表膜抗原(Sj TA)基因。将Mf ILKAP和Sj TA基因分别克隆至真核表达载体Flag-pCMV-2b和Myc-pcDNA3.1/(-) b中,构建的重组质粒FlagILKAP-pCMV-2b和Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b共转染至HEK293T细胞中作为实验组,设阴性对照组Myc-TApcDNA3.1/(-) b或Flag-ILKAP-pCMV-2b和空白对照组Myc-pcDNA3.1/(-) b或Flag-pCMV-2b。用抗体Myc、 Flag以及ILKAP分别与转染后的HEK293T细胞总蛋白进行免疫共沉淀和蛋白质印迹(Western blotting)分析。结果东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白经过免疫共沉淀实验,结果显示,实验组与阴性对照组、阳性对照组相比,有差异条带。经MAIDI-TOF-MS鉴定,利用Mascot软件中的串级质谱数据搜索功能进行搜索鉴定,鉴定出与东方田鼠ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种。RT-PCR结果显示, ILKAP和TA在东方田鼠骨髓和日本血吸虫童虫中均有表达,东方田鼠骨髓ILKAP的扩增产物为1 100～1 200 bp,理论值为1 147 bp,日本血吸虫童虫TA基因的扩增产物大小为500～600 bp,理论值为561 bp。质粒pCMV-Tag 2b、 pcDNA3.1/myc-His (-) b经酶切后,均有单一条带,分别约为4 300、 5 500 bp;重组质粒Flag-ILKAP-pCMV-2b经酶切鉴定后,其大小分别为4 300和1 147 bp, Myc-TA-pcDNA3.1/(-) b经酶切鉴定后,其大小分别为5 500和561 bp。Western blotting分析结果显示,两种重组真核表达载体共转染实验组的PVDF膜分别与Myc、 Flag以及ILKAP抗体孵育后有条带出现,而其他对照组无条带出现。结论鉴定出与Mf ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种,在HEK293T细胞中共表达了与Mf ILKAP结合的Sj TA基因, Mf ILKAP与Sj TA之间存在直接相互作用。

湖南省生物化学与分子生物学学会2013年学术年会暨会员代表大会在长沙市召开

湖南省生物化学与分子生物学学会于2013年10月19日在湖南省长沙市中南林业科技大学召开了2013年学术年会暨会员代表大会。来自全省的会员代表及科技工作者200余人参加了本次会议和学术交流活动。