CRISPR/Cas系统对金黄色葡萄球菌耐药及毒力基因的影响

【目的】了解金黄色葡萄球菌(以下简称“金葡菌”)Staphylococcus aureus中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布情况,分析其对抗生素耐药基因和毒力基因水平转移的影响。【方法】从公共数据库获取组装完整的金葡菌基因组575个,利用生物信息学方法,统计CRISPR结构的携带情况,菌株多位点序列分型(Multi-locus sequence typing,MLST)型别分布和菌株耐药基因、毒力基因的分布情况;对CRISPR结构阳性(CRISPR+)和CRISPR结构阴性(CRISPR-)的金葡菌耐药基因和毒力基因携带数目进行差异显著性分析。同时对实验室60株金葡菌二代测序数据进行分析,验证公共数据库分析结果。对实验室60株金葡菌中原噬菌体、接合质粒的携带情况进行统计,讨论CRISPR结构对菌株原噬菌体和接合质粒的影响。【结果】基因组组装完整的575株金葡菌中,有62株携带CRISPR结构(CRISPR+),513株不携带CRISPR结构(CRISPR-);CRISPR+金葡球菌携带耐药基因、毒力基因的数目显著小于CRISPR-金葡菌。实验室60株金葡菌中,有14株为CRISPR+,46株为CRISPR-;CRISPR+金葡菌携带更少的耐药基因和毒力基因,与公共数据库分析结果一致。对原噬菌体和接合质粒的分析结果显示,CRISPR-菌株携带更多的原噬菌体序列,与CRISPR+菌株之间差异显著(P<0.05);接合质粒方面,CRISPR-和CRISPR+菌株无显著性差异。【结论】CRISPR结构可能限制了金葡菌中耐药基因和毒力基因的水平转移,CRISPR-菌株更容易受到噬菌体和可移动质粒的干扰。本研究为进一步研究金葡菌耐药基因和毒力基因的传播提供了参考。

1株可裂解bla_(NDM-5)及mcr-1阳性大肠杆菌噬菌体的分离与生物学特性

旨在分离1株可裂解bla_(NDM-5)及mcr-1阳性大肠杆菌的噬菌体,探究该噬菌体的生物学特性,为防控bla_(NDM-5)及mcr-1阳性大肠杆菌感染提供新的技术思路。对分离出的噬菌体进行透射电镜观察、最佳感染复数、一步生长曲线等生物学特性试验及全基因组测序分析。结果显示:成功分离出1株大肠杆菌噬菌体vB_EcoM-ZQ1,该噬菌体属于有尾病毒目,肌尾病毒科,其最佳感染复数为0.1,潜伏期为20 min,裂解期为10 min,裂解量为92 PFU·cell^(-1)。在温度4~55℃、pH4~10条件下,该噬菌体都有较高的活性。其对多重耐药大肠杆菌有一定裂解作用,裂解率为25.5%。该噬菌体基因全长149112 bp,GC含量为49.1%,共有184个ORF,其中70个ORF编码功能蛋白,有2个ORF编码tRNA,并未发现含有耐药基因与毒力因子;经BLAST比对发现,噬菌体与Shigella phage phiSboM-AG3有92.37%的相似性,基于噬菌体末端酶大亚基构建的同源进化树结果可得结论,噬菌体vB_EcoM-ZQ1和与沙门菌噬菌体pSal-SNUABM-02的亲缘关系最近。综上提示,噬菌体vB_EcoM-ZQ1,生物学特性稳定,基因结构完整,为后续bla_(NDM-5)及mcr-1阳性大肠杆菌感染的防控奠定了一定前期基础。

洛克沙胂、阿散酸对蚯蚓和鱼的生态毒理学指标影响的研究进展

洛克沙胂和阿散酸作为畜禽添加剂应用极其广泛,然而人们对其代谢残留对环境中各种生物的毒性影响却知之甚少。本文综述了洛克沙胂、阿散酸对蚯蚓和鱼的一些生态毒性学指标的影响,包括对关键酶系的影响和细胞DNA的损伤情况,并对以后的科研工作提出了新的思路。

动物源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力与分子分型关系研究

【目的】调查产生生物被膜的金黄色葡萄球菌流行病学特征,探究生物被膜形成能力与分子型之间的相关性,为治疗动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据。【方法】以广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存的98株金黄色葡萄球菌为研究对象,用结晶紫半定量法测定所有菌株生物被膜形成能力,将产膜菌株进行22种常见抗菌药的最小抑菌浓度测定,通过金黄色葡萄球菌常见3种(spa、MLST和PFGE)分型方式进行分子分型,并分析产膜能力与分子型之间的相关性,最后通过全基因组测序技术分析生物被膜产生菌株中耐药基因和毒力基因携带状况。【结果】结晶紫半定量结果显示,98株金黄色葡萄球菌中能产生生物被膜的菌株共计23株,占23.47%。包括牛乳源22株(占比25.29%,22/87),其中14株(占比60.87%,14/22)来自浙江奶牛养殖场,8株(占比39.13%,8/22)来自福建奶牛养殖场,以及猪源1株(占比9.10%,1/11),来自广东屠宰场,说明牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力高于猪源;将产膜能力划分为强、中、弱3个等级,23株产膜菌株中,其中强产膜菌株2株(占比8.70%,2/23),中产膜菌株9株(占比39.13%,9/23),以及弱产膜菌株12株(占比52.17%,12/23)。药敏试验显示,牛乳源产膜菌株对所有受试抗菌药物敏感,而猪源产膜菌株对青霉素、阿莫西林、头孢噻呋、头孢西丁、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素、多西环素、红霉素、氟苯尼考、复方新诺明、泰妙菌素、替米考星13种抗菌药均表现出耐药;spa分型结果显示,98株金黄色葡萄球菌共获得8种spa型,产膜的23株金黄色葡萄球菌占其中3种:1株t2922型来自广东猪源,14株t2119来自浙江牛乳源,8株t189来自福建牛乳源;MLST分型结果显示,98株菌共分为9种ST型,其中6种ST型不具有产生生物被膜的能力,分别为ST398、ST522、ST705、ST1651、ST479和ST151,仅3种ST型的菌株具有生物被膜产生能力,分别为ST9、ST7和ST188。结果表明,强产膜菌株分子型主要为ST7-t2119,中产膜菌株主要为ST7-t2119和ST188-t189,弱产膜菌株为ST9-t2922、ST7-t2119和ST188-t189;同时结合PCA分析不同ST型组间差异性发现,弱产膜菌株的ST型能与中强产膜菌株很好的区分开来,只有特定ST型的金黄色葡萄球菌才具有产生生物被膜的能力。23株产膜菌株PFGE分型全部成功,结果显示,广东、福建、浙江三省产膜菌株共分为3种PFGE型,且PFGE型存在地域分布特征,同一地区的分离株可能存在克隆传播,但克隆株之间生物被膜产生能力有明显差异;全基因组测序结果显示,产膜菌株中耐药基因和毒力基因根据分子型不同携带情况呈现多样性。【结论】不同来源的金黄色葡萄球菌有不同程度产生生物被膜的潜力,且均携带多种不同的产膜基因,牛乳源金黄色葡萄球菌产膜潜力远远高于猪源;菌株能否产膜与ST型存在强相关性,特定的ST型如ST9、ST7和ST188更容易产生生物被膜。

热可膨胀微球的影响因素及成粒过程的研究进展

热可膨胀微球是一种以热塑性聚合物为壳层、发泡剂(低沸点的烷烃或其他化合物)为核的具有核-壳结构的聚合物粒子,具有广泛的应用领域。总结国内外学者研究成果,主要介绍了单体、交联剂、发泡剂、引发剂、聚合温度及助剂等主要影响因素对热可膨胀微球制备过程、微球颗粒特性及膨胀性能的影响,重点阐述了热可膨胀微球的成粒过程及机理,并对热可膨胀微球的发展前景及研究方向进行了展望。

基于CRISPR-Cas12a系统的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法的建立

为了建立一种特异性强、灵敏度高的鼠伤寒沙门氏菌可视化检测方法,试验将聚合酶链式反应(PCR)与成簇的有规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated, CRISPR-Cas)系统相结合,首先根据鼠伤寒沙门氏菌的spy基因序列3′末端的保守区设计crRNA及靶标序列扩增引物,根据可视化检测原理设计单链DNA(single-stranded DNA, ssDNA)荧光报告探针;然后对靶标序列进行PCR扩增,将扩增产物加入CRISPR-Cas12a系统,在蓝光下通过肉眼观察是否产生绿色荧光实现对靶标的检测;最后进行特异性试验和灵敏度试验。结果表明:建立的方法仅能检测到鼠伤寒沙门氏菌,检测不到除鼠伤寒沙门氏菌外其他血清型的沙门氏菌及大肠杆菌、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌,能检测到循环数为14个的PCR产物和0.53 copies/μL的重组质粒,灵敏度优于常规PCR方法和实时荧光定量PCR方法。说明本试验建立的方法可以实现鼠伤寒沙门氏菌的可视化检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。

多重耐药大肠杆菌中前噬菌体的分布特征及诱导分离

【目的】通过调查前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中的分布特征、诱导分离以及前噬菌体中耐药基因与毒力基因的流行状况,为研究前噬菌体介导耐药基因在细菌的传播提供科学依据。【方法】挑选前期保存的2018-2019年广东省分离的131株禽源多重耐药大肠杆菌进行核酸提取及全基因组测序,将二代测序的结果组装拼接成全基因组序列,上传至噬菌体PHASTER网络数据库与数据库中已有的噬菌体基因组序列进行比对分析。利用CGE数据库比对耐药基因与毒力基因,从而获得在前噬菌体上耐药基因与毒力基因的分布情况。温和性噬菌体由丝裂霉素C诱导并使用双层平板法分离纯化。【结果】131株大肠杆菌药物敏感性试验的结果显示,氨苄西林、四环素、氟苯尼考、复方新诺明的耐药率均高达90%以上,其次是头孢类抗生素以及庆大霉素、环丙沙星、美罗培南和黏菌素均在50%左右,替加环素的耐药率达到了0.2%,所有菌株都呈现出多重耐药的现象,均为多重耐药大肠杆菌。131株多重耐药大肠杆菌中共检出736个前噬菌体片段,其中包含329个完整型前噬菌体,其与40个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上;可疑型噬菌体有66个,其与20个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上;不完整型噬菌体有341个,其与52个已知数据库噬菌体物种以不同百分比匹配上,完整型前噬菌体的基因序列显示出与已知的噬菌体物种的序列相似性最高,平均为58.53%;131株大肠杆菌中平均前噬菌体数量为5.6个,平均总含量为152.4 kb。前噬菌体基因组占其宿主基因组的比例分布在0.58%-5.87%,以3.0%为主。前噬菌体基因组长度范围在2.8-107.9 kb,其中13.0 kb的前噬菌体出现的频次最高,占所有前噬菌体的9.1%。CGE比对结果表明,131株多重耐药大肠杆菌的基因组共在18株前噬菌体序列检测到耐药基因mdf(A)、lnu(G)和mcr-1,其中mdf(A)、lnu(G)和mcr-1检出数分别为16、1和1。71株多重耐药大肠杆菌前噬菌体中携带有6种不同的毒力基因,其中存在部分菌株携带2种或者3种毒力基因,有62株前噬菌体携带端粒酶RNA基因terC,16株前噬菌体携带血清存活率增加基因iss,外膜蛋白酶ompT、黏附素基因iha、cvaC和ABC转运蛋白基因mchF分别在2、2、1和1株前噬菌体中检出。mdf(A)和terC分别是前噬菌体中最常见的耐药基因和毒力基因。温和性噬菌体诱导试验结果显示,前噬菌体的诱导成功率为84.0%,但出现噬菌斑的概率仍比较低。【结论】前噬菌体在多重耐药大肠杆菌中分布广泛且携带有多种耐药基因和毒力基因,温和性噬菌体诱导成功率高,具有携带耐药基因及毒力基因水平传播的风险,需要加强和持续监测。

广东肇庆地区鸭疫里氏杆菌耐药性和毒力基因分析及ERIC-PCR分型研究

为了解广东省肇庆市鸭疫里氏杆菌的流行和耐药现状,本试验对当地4个养鸭场疑似传染性浆膜炎的病鸭进行细菌分离纯化、PCR鉴定,并对分离菌株进行了药敏试验、耐药基因、毒力基因检测及ERIC-PCR分型试验。药敏结果表明,14株鸭疫里氏杆菌对新霉素、安普霉素、恩诺沙星、替加环素、复方新诺明高度耐药,耐药率均为100%;对阿莫西林、头孢他啶和环丙沙星敏感度较高,敏感率分别为100%、100%和92.86%。耐药基因检测结果显示,所有分离菌均携带tet(X)和floR耐药基因,tet(B)和su l1耐药基因的检出率分别为64.29%和50%,其余9种耐药基因(aac(6′)-Ⅰb、aph(3')-Ⅱ、bla_(SHV)、bla_(DHA)、qnrA、qnr B、tet(A)、tet(C)、sul2)未被检出。毒力基因检测结果显示,AS87_04050、luxE和wza毒力基因的检出率较高,分别为100%、92.86%和100%,而TbdR 1均未被检出。ERIC-PCR分型试验结果表明,14株鸭疫里氏杆菌均成功分型,相似性在90%时,可分为7个基因型。本实验为广东省肇庆市鸭疫里氏杆菌病的治疗措施提供理论依据。

广东省猪源葡萄球菌耐药性分析及多重耐药基因cfr的流行现状

为了解2013-2017年间广东省猪源葡萄球菌的耐药情况及多重耐药基因cfr的流行现状,采集生猪养殖场和交易市场猪鼻腔拭子分离葡萄球菌,采用琼脂稀释法测定分离菌株对14种抗菌药物的敏感性,并用PCR检测mecA和cfr基因的携带情况。结果显示,在采集的4099份样品中分离到葡萄球菌1485株,其中金黄色葡萄球菌173株。猪源葡萄球菌对红霉素、四环素、泰妙菌素、克林霉素、沃尼妙林和氟苯尼考耐药严重,耐药率分别为91.0%、90.2%、87.7%、84.6%、84.6%及82.0%,对利福平和利奈唑胺相对敏感,未发现万古霉素耐药菌株;庆大霉素、四环素、红霉素和环丙沙星的耐药率呈现逐年上升的趋势。在1485株葡萄球菌中,mecA和cfr的检出率分别为39.9%和12.3%。cfr阳性菌株常携带多种耐药基因,cfr基因的遗传背景也呈现多样化。结果表明,广东省猪源葡萄球菌的耐药情况严重,cfr的检出率高,应加强养殖业中抗菌药物的规范和合理使用,减缓耐药性的产生和传播。

市售畜禽肉产CTX-M酶大肠杆菌的流行病学调查

【目的】调查市售畜禽肉类中大肠杆菌的耐药状况和blaCTX-M基因的流行病学特征。【方法】采集广州市不同区域零售市场和超市畜禽肉类样品进行大肠杆菌的分离,通过基因phoA扩增和测序进行大肠杆菌鉴定,采用琼脂扩散法和微量肉汤稀释法测定药物敏感性,通过PCR扩增检测blaCTX-M基因,对blaCTX-M阳性大肠杆菌进行全基因组测序。【结果】从323份市售畜禽肉样品中分离获得大肠杆菌241株;药物敏感性结果表明大肠杆菌对氨苄西林(63.07%)、多西环素(47.72%)和复方新诺明(43.15%)耐药率较高;blaCTX-M基因检出率为3.32%(n=8),其中4株携带blaCTX-M-14,3株携带blaCTX-M-65,1株携带blaCTX-M-55;8株产CTX-M大肠杆菌可分为4种不同的ST型,且携带多种耐药基因和毒力基因。【结论】市售畜禽肉中大肠杆菌污染严重。产CTX-M酶大肠杆菌均为多重耐药菌株,且blaCTX-M基因主要以水平传播方式在大肠杆菌中传播,需要加强监测。

广东省某猪场链球菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解猪源链球菌的流行情况及耐药特征,从广东省某猪场共采集150份猪鼻拭子,利用保守基因EF-Tu进行猪源链球菌的分离鉴定;采用琼脂扩散法测定链球菌分离株对13种抗菌药物的敏感性;PCR检测四环素类耐药基因tet(O)、tet(M)、tet(L)、tet(K),噁唑烷酮类耐药基因optrA、cfr、poxtA,大环内酯类耐药基因erm(A)、erm(B)、erm(C)、mef(A),磺胺类耐药基因Sul1、Sul2、Sul3,氨基糖苷类耐药基因ApH3′,酰胺醇类耐药基因cat1、cat2,β-内酰胺类耐药基因pbp2b。结果显示,150份猪鼻拭子样品中共分离出40株链球菌,分离率为26.67%。药敏结果显示,40株链球菌对克林霉素、四环素、红霉素、氟苯尼考的耐药率较高,分别为92.50%,90.00%,85.00%和80.00%,且呈现多重耐药表型,多重耐药率高达87.50%;对阿莫西林、头孢噻呋、美罗培南等药物仍较为敏感。耐药基因检测显示,四环素类耐药基因中tet(M)检出率最高,为60.00%,其次为tet(O)(35.00%)、tet(K)(2.50%);大环内酯类耐药基因中erm(B)较为流行(50.00%);磺胺类耐药基因中Sul1检出率较高(62.50%),其次为Sul2(27.50%)和Sul3(22.50%);氨基糖苷类耐药基因ApH3′检出率为72.50%,酰胺醇类耐药基因cat1、cat2和β-内酰胺类耐药基因pbp2b均未检出。