CRISPR/Cas9系统介导的EZH2基因定点敲入Hut78细胞系的构建

目的利用CRISPR/Cas9系统构建定点敲入EZH2基因的Hut78细胞系。方法构建EZH2表达载体pMD-18T-EZH2和单向导RNA(sg RNA)表达载体pSpCas9(BB)-2A-Puro-sg RNA,将两个载体共转染Hut78细胞,通过qPCR检测EZH2 mRNA的表达情况,通过Western Blot检测EZH2和H3K27me3蛋白的表达情况。结果测序结果显示,构建的pMD-18T-EZH2和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sg RNA表达载体插入序列完全正确。将构建的两个质粒共转染Hut78细胞,qPCR结果显示EZH2基因在RNA水平上表达显著上调;Western blot结果显示EZH2和H3K27me3蛋白表达水平显著提高。结论通过CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入EZH2基因的Hut78细胞系。

抗-G联合抗-D致新生儿溶血病并D抗原遮蔽1例

目的研究1例RhD阴性产妇所育新生儿因D抗原遮蔽现象造成血清学假阴性的特点,及分析新生儿发生溶血病多次配血不合的原因,探讨提高抗体检出率的方法,及时解决新生儿HDFN的输血救治问题。方法采用盐水法和微柱凝集法结合吸收放散实验鉴定产妇及新生儿的抗体,RhCE exon1-10外显子测序鉴定新生儿血型,找到相匹配的血液给新生儿换血治疗。结果新生儿血型初次鉴定为AB、ccdEe,患儿母亲血型为AB、ccdee;患儿红细胞经ZZAP处理及基因鉴定后Rh分型为ccDEe;母亲、新生儿游离血清及新生儿红细胞放散液中检测出抗-D+抗-G。测得产妇血清中抗-D效价为1024、抗-G效价为8;患儿抗-D与抗-G效价分别为128、4。从血库中筛选出与新生儿血清交叉配血相匹配的0型洗涤红细胞。结论产妇抗-D可导致新生儿D抗原完全遮蔽,在临床检测过程中需采用多种血清学方法结合基因方法鉴定;对RhD阴性的孕妇要进行产前抗体筛查和鉴定,新生儿注射免疫球蛋白后交叉配血要格外关注,及时为新生儿发生HDFN的换血输血提供了相匹配血液具有十分重要的意义。

大鼠EZH2基因过表达质粒以及催化亚基缺失质粒构建及鉴定

目的 构建特异性的大鼠EZH2过表达质粒以及EZH2催化亚基SET domain缺失质粒，并在293T细胞中评估其表达水平。 方法 提取大鼠心脏组织RNA，逆转录为cDNA，重叠PCR扩增催化亚基SET domain缺失的EZH2的cDNA，以其为模板进行PCR扩增，将PCR产物和载体双酶切，切胶回收目的片段，经T4连接酶连接，连接产物转入感受态细胞，涂板挑取单克隆摇菌测序，提取质粒，采用脂质体转染法转染293T细胞。 结果 Western Blot 法和RT-PCR法检测结果表明，质粒在293T细胞中实现EZH2基因的过表达。 结论 构建的2种质粒为进一步研究EZH2基因与心肌肥厚的关系及EZH2催化亚基的作用奠定了基础。