利用酵母双杂交系统筛选本氏烟中与RGSV P5互作的蛋白

【目的】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSV P5是该病毒的沉默抑制子,在抵抗寄主RNA沉默中发挥重要作用。筛选、鉴定与水稻草状矮缩病毒(RGSV)沉默抑制子P5互作的寄主蛋白,为揭示水稻草状矮化病毒致病的分子机制提供理论基础,为该病毒病的防治提供有效策略。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主蛋白。提取感染水稻草状矮化病毒的水稻叶片的总RNA。依据P5基因的CDS序列设计特异性引物。利用RT-PCR技术获得P5基因,将P5基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,利用双酶切鉴定诱饵质粒。将诱饵载体pGBKT7、pGBKT7-P5、重组质粒pGBKT7-P5/pGADT7分别转化到酵母感受态细胞Y2H Gold中,通过观察其在缺陷培养基SD/-Trp、SD/-Leu-Trp/上的生长情况及在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上的显色情况检测诱饵质粒的毒性和自激活活性。将烟草酵母cDNA文库质粒转化到含诱饵载体pGBKT7-P5的酵母感受态细胞中,先后用不同缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal筛选后获得阳性克隆。经酵母质粒提取、转化、测序和Blast等分子生物学方法最终获得互作蛋白的序列。【结果】RT-PCR扩增得到P5基因,其大小为576 bp。成功构建诱饵载体pGBKT7-P5。表达的诱饵蛋白P5对酵母菌没有毒性和自激活活性。诱饵蛋白P5从本氏烟酵母cDNA文库中进行大量筛选,获得15个阳性克隆,分析后最终得到7个与P5互作的本氏烟蛋白。经生物信息学分析它们分别为线粒体孔蛋白VDAC、ADP核糖基化因子GTP水解酶激活蛋白ArfGAP、囊泡突触结合蛋白Syt-2、延伸因子eEF1A、脯氨酸合成酶共转录的细菌同源蛋白PROSC、非特征蛋白C9orf78及一种未知蛋白。【结论】本研究成功筛选到7个与水稻草状矮化病毒P5互作的寄主因子。这些互作的寄主因子主要参与转运、生物或非生物胁迫、胁迫应答等生物学过程。深入研究这些互作因子将为解析寄主蛋白参与调控病毒的复制、运动、致病等分子机制提供理论基础,为水稻草状矮化病毒病的防治提供新的思路。

莴笋链格孢叶斑病病原鉴定及室内生防菌剂筛选

【目的】明确江西省南昌市郊区莴笋链格孢叶斑病病原菌种类,筛选出能有效防治该病害的生防菌剂。【方法】采用组织分离法对莴笋链格孢叶斑病进行病原菌分离纯化,选择代表性菌株WS1作为供试菌株进行孢子悬浮液刺伤接种,再对接种发病的病斑进行病原菌再分离,以完成柯赫氏法则验证,最后对分离所得病原菌进行形态学鉴定;采用真核生物核糖体基因转录间隔区rDNA-ITS以及过敏原基因Alt a1分别对病原菌进行PCR扩增和序列测定,使用BLAST软件,在GenBank中进行序列同源性比对,并利用MegA 7.0软件构建系统发育树,以对病原菌进行分子鉴定。采用对峙培养法测定8种常见市售生防菌剂对该病原菌的室内抑菌效果。【结果】共分离获得23个培养性状一致的链格孢菌株,其对莴笋叶片均具有致病性。病原菌在PDA培养基上菌落圆形,中间灰褐色,边缘白色,菌丝体茂密呈绒状,后期正面中央颜色加深成暗青褐色,背面呈黑褐色,菌落平均生长速度10.86 mm/d。分生孢子倒棍棒形或椭圆形,淡褐色至褐色,具0~6个横隔、0~3个纵隔和0~2个斜隔,孢身大小14.60~40.09μm×6.61~14.44μm。短喙柱状或锥形,淡褐色,大小1.84~8.29μm×2.60~4.35μm。分生孢子链生于分生孢子梗上,主链一般不超过10个孢子,支链不超过5个孢子。其培养性状和形态特征与文献中对交链格孢(Alternaria alternata)的描述相吻合。测定的rDNA-ITS和Alt a1基因的序列长度分别为570 bp和472 bp,序列登录号分别为OP161641和OP185144,与GenBank中交链格孢对应序列的同源性均为100%,并在系统发育树上处于同一个分支且支持率为99%。通过形态学和分子生物学将此病原菌鉴定为交链格孢(A.alternata)。在室内生防菌剂筛选试验中,地衣芽孢杆菌、荧光假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、蜡质芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌的抑菌率均高于63%,其中地衣芽孢杆菌和荧光假单胞菌抑菌效果突出,抑菌率分别高达75.42%和72.74%。【结论】确定江西省南昌市郊区莴笋链格孢叶斑病的病原菌为交链格孢(A.alternata),地衣芽孢杆菌和荧光假单胞菌可作为下一步莴笋链格孢叶斑病田间防效试验的候选生防菌剂。

江西都昌茶链格孢叶霉病病原鉴定

【目的】明确江西省都昌县“黄金叶”茶树链格孢叶霉病病原菌种类。【方法】2021年4月从江西省都昌县朱恋春茶场采集链格孢叶霉病叶片,按常规组织分离法进行病菌分离和纯化,通过观察病菌的培养性状和分生孢子、分生孢子链的形态特征,结合rDNA-ITS、Alt α1和GAPDH基因的序列分析,对病菌进行种类鉴定,并依据柯赫氏法则验证其致病性。【结果】从病叶中共分离到19株培养性状和形态特征一致的链格孢属菌株,菌落圆形,中央墨绿色,边缘灰白色,菌丝浓密,背面深褐色,有不明显的轮纹,平均生长速率8 mm/d。分生孢子梗褐色,单生,直立或弯曲,其上链状着生分生孢子。分生孢子椭圆形、卵形或倒棍棒形,深褐色,有3~5个横隔膜,0~3个纵隔膜,分隔处不缢缩或略缢缩,大小(17.4~36.3)μm×(8.3~14.4)μm(n=50)。分生孢子顶端有喙或无喙,喙短柱状或锥状,有的喙可转变为分生孢子梗继续产孢,使分生孢子链出现分支,主链一般不超过10个孢子,支链一般有1~5个孢子。代表性菌株JXAA1、JXAA2、JXAA3具有完全相同的rDNA-ITS、Alt α1和GAPDH基因序列,且与GenBank中链格孢(Alternaria alternata)对应序列的相似性为100%。按rDNA-ITS、Alt α1和GAPDH基因顺序拼接构建多基因系统发育树,与链格孢(A. alternata)聚类成一个分支而其他种类菌株各构成独立分支。将上述3个菌株分别接种健康叶片,7 d后接种处均出现圆形黑褐色病斑,引起的症状与田间症状相同,并从病斑中再次成功分离到原病菌,对照接种无发病。【结论】确定江西都昌县“黄金叶”茶链格孢叶霉病的病原菌为链格孢(A. alternata),这是在江西首次发现链格孢引致茶叶病害。

百合根腐病病原分离与鉴定

【目的】百合根腐病是严重为害百合鳞茎的一种土传病害,其病原种类多样,已成为遏制百合产业发展的重要因素之一。研究从百合根腐病的病样中分离得到多种分离物,选取其中2种做进一步鉴定。【方法】采用组织分离法对江西省鹰潭市余江区杨溪乡发生的百合根腐病样品进行病原分离,进一步通过形态观察、ITS和tef1序列比对以及致病性测定对病原进行鉴定。【结果】明确引起百合根腐病的病原为藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)和茄病镰刀菌百合专化型(Fusarium solani f.sp.lilii Wang)。【结论】研究从江西余江区采集的龙牙百合病鳞茎组织上分离得到两种代表性镰刀菌,分别为藤仓镰刀菌和茄病镰刀菌百合专化型。研究结果为百合根腐病的预防和防治提供了参考依据。

纽荷尔脐橙叶片和幼果内生细菌群落多样性及其功能预测

【目的】柑橘溃疡病是脐橙上的一种重要病害,影响其发生的因素较多。通过了解纽荷尔脐橙内生细菌群落组成和其潜在的生物学功能,探索内生细菌在脐橙感染溃疡病中的作用。【方法】从纽荷尔脐橙树上随机采集未表现任何病害症状的幼果和嫩叶,嫩叶分别在春、夏、秋3个季节进行采样,每个样品设3个重复。对4个样品进行表面消毒后从中提取DNA,PCR在25μL反应体系中进行,扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳检查,选取主条带清晰的400~500 bp片段进行测序。采用基于16S rRNA基因V3-V4可变区的高通量测序技术及Tax4Fun功能预测对纽荷尔脐橙内生细菌菌群及其功能进行了测定和分析。各样本数据在FLASH V1.2.7上进行拼接,利用QIIMEV1.7.0对产生的原始数据进行质控,用Uparse V7.0.10012对有效数据进行聚类,在97%的相似度水平上生成OTU。为每个OTU挑选一个代表序列,并使用SSUrRNA数据库进行物种注释分析使用,获得分类学信息并分别在各个分类水平统计各样本的群落组成,并用MUSCLE(V3.8.31)进行α多样性(样本内)和β多样性(样本间)分析。通过UProC和PAUDA 2种方法将功能信息对应到SILVA数据库中,实现功能注释。【结果】季节和采摘部位对脐橙内生细菌群落组成的多样性和物种丰富度存在一定的差异,脐橙幼果中的内生细菌数量多于叶片,夏季相较于其他季节内生细菌群落丰富度更高;脐橙内生细菌群体在门水平上的组成相似,但丰度占比不同,且厚壁菌门、变形菌门和蓝菌门为主要优势门,各优势细菌纲数目、组成及其丰度随不同脐橙样本而异,芽孢杆菌属为主要优势属;Tax4Fun功能预测显示纽荷尔脐橙内生细菌包含大量关于膜运输、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、翻译、复制和修复、能量代谢、辅因子和维生素的代谢等基因信息,其中功能基因丰度较大的为碳水化合物代谢和氨基酸代谢,且脐橙夏天叶片的细胞过程和环境信息处理功能信息高于其他3种样品,幼果的遗传信息处理、新陈代谢、有机系统和人类疾病功能信息高于其他3种样品。【结论】纽荷尔脐橙内生细菌群落多样性丰富,具有大量代谢相关的有益菌,研究结果可为今后探索纽荷尔脐橙内生细菌菌群的利用和柑橘溃疡病的生物防治提供思路。

利用小RNA测序鉴定江西奉新猕猴桃病毒种类

为探明江西省奉新县猕猴桃感染病毒的情况,2020年5月从该县山口、农合和新西蓝3个主要猕猴桃种植区共采集23份疑似病毒病叶片样品,利用小RNA深度测序技术对混合样品进行病毒检测,并通过RT-PCR和测序验证。结果共检测出4种病毒,分别是猕猴桃病毒A(Actinidia virus A,AcVA)、猕猴桃病毒B(Actinidia virus B,AcVB)、猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspots associated virus,AcCRaV)和柑桔叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus,CLBV),在23份样品中的检出率依次为87.0%、56.5%、65.2%和60.9%,多数样品存在病毒复合侵染,复合侵染率81.8%。表明引起奉新县猕猴桃病毒病的毒原主要有AcVA、AcVB、AcCRaV和CLBV 4种,优势毒原为AcVA,病毒复合侵染发生普遍。

新课标背景下利用生活情境开展小学数学教学的策略

《义务教育数学课程标准(2022 年版)》指出,数学课程应致力于培养学生的数学应用意识,提升学生的实践能力,使学生获得基本的数学活动经验。教师应创设生活情境,激发学生的学习兴趣,引导学生主动探索、自主学习、合作交流。文章结合相关文献和笔者多年的实践经验,总结了生活情境在小学数学教学中应用的有效策略,希望可以为广大小学数学教师提供一些借鉴,从而提高小学数学教学质量。

南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达

【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。

水稻蛋白激酶OsCIPK5的亚细胞定位分析及RNAi转基因水稻的获得

在植物生长发育中,CIPKs(CBL-interacting protein kinases)在胁迫信号转导和增强抗逆途径中发挥着重要作用,而OsCIPK5的具体功能还未知。为了研究OsCIPK5的功能,本研究从日本晴水稻中成功克隆了OsCIPK5基因。用生物信息学方法对其编码的蛋白进行分析,结果表明OsCIPK5含有2个功能区即激酶活性区和NAF区,OsCIPK5与5种植物的CIPK5同源性较高,而与短花药野生稻CIPK5的同源性最高(94%),亲缘关系最近。利用植物生理学方法对水稻进行低钾处理,结果表明水稻根中OsCIPK5受低钾诱导表达,而叶片中OsCIPK5表达量没有变化;同时构建了OsCIPK5与黄色荧光蛋白基因融合的植物瞬时表达载体,共聚焦显微镜观察显示,OsCIPK5编码的蛋白主要定位在细胞核、细胞膜,还以颗粒状结构不规则分布在细胞质中。进一步构建了OsCIPK5的RNAi载体,通过水稻遗传转化体系获得26株阳性转基因水稻。荧光定量PCR(Real-time qPCR)分析表明,T1代转基因水稻中OsCIPK5的表达量与野生型相比显著降低。OsCIPK5的生物信息学分析、植物生理学分析、亚细胞定位以及RNAi转基因水稻的获得为研究OsCIPK5的功能奠定了基础。

体重指数与血压、血糖、血脂的关系

调查体检人群体重指数（BMI）与血压、血糖、血脂的关系.方法对2013年我院体检中心10005 例男性体检资料进行分析,根据BMI分为正常组、超重组和肥胖组,分别比较三组之间血压、血糖、血脂以及高血压、高血脂、糖尿病的检出率等指标.结果：三组在各项指标差异有统计学意义（P〈0.01）,超重组和肥胖组的血压、血糖、血脂与正常组的差异有统计学意义（P〈0.01）,超重组和肥胖组在血压、血脂差异有统计学意义.且三组在高血压、高血脂、糖尿病的检出率方面的差异有统计学意义.体重指数与血压、血脂、血糖之间存在正相关关系（P〈0.01）.结论：超重和肥胖影响血压、血脂、血糖,与心血管疾病危险因素密切相关.

一株拮抗芋头干腐病的贝莱斯芽孢杆菌的筛选与鉴定

【目的】筛选并鉴定对芋头干腐病菌具有显著拮抗作用的芽孢杆菌,为有效防控芋头干腐病提供生防资源。【方法】采用稀释平板分离法从茶树根际土壤中分离芽孢杆菌;以芋头干腐病的优势病原菌茄镰刀菌(Fusarium solani)为靶标菌,采用平板对峙法筛选拮抗菌株,并测定拮抗菌株的抑菌范围;通过形态观察、生理生化特性测定和16S rDNA、gyrA、rpoB基因序列分析,对拮抗菌株进行种类鉴定。【结果】筛选到1株对芋头干腐病菌具有显著抑菌效果的菌株,命名为D-1。该菌株对供试的其他9种植物病原真菌和5种植物病原细菌也有显著的抑菌作用。D-1菌落圆形、乳白色、不透明、表面干燥皱褶、边缘不整齐、中央凹陷;生理生化特性测定结果与对照菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FJ17-4的测定结果一致;测定的16S rDNA、gyrA和rpoB 3个基因序列与GenBank中B.velezensis对应序列的同源性均为100%;在分别基于16S rDNA、gyrA和rpoB基因序列构建的系统发育树上,该菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)各菌株聚类成一个分支。【结论】根据形态特征、生理生化特性和多基因序列分析结果,鉴定菌株D-1为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis),该菌株抑菌活性强,抑菌谱广,在植物病害生物防治中具有应用潜力。

特殊时期植物病理学相关课程网络教学的思考

特殊时期,网络教学成为各高校实现“停课不停教,停课不停学”教学目标的主要方式。本文对江西农业大学植物病理学相关课程网络教学的实施情况和效果进行了总结,并提出了一些建议,以期为今后植物病理学相关课程的教学提供参考。

一株侵染黄桃果实的葡萄座腔菌菌株鉴定

【目的】明确从江西省井冈山市“锦绣”黄桃病果上分离到的1株葡萄座腔菌的种类归属及其致病性。【方法】对黄桃病果进行症状描述,使用PDA平板按照常规真菌分离法从病果中分离病菌并进行菌种纯化,观察该菌的培养性状和形态特征,测量其分生孢子器和分生孢子大小,根据观测值,依据相关文献对其进行形态学鉴定。提取该菌株基因组DNA,对rDNA-ITS、EF-1和β-tubulin基因分别进行PCR扩增和测序,将测定序列输入到NCBI中利用BLAST程序搜索其同源序列并构建系统发育树,根据序列同源性大小和亲缘发生关系,对该菌株进行分子生物学鉴定;采用菌饼接种法分别对健康的桃一年生枝条和果实进行刺伤接种,测定该菌株的致病性。【结果】该黄桃病果病斑褐色、圆形或不规则形,病健交界不清楚,病斑果皮较完好,内部果肉变软腐烂。从病果中分离获得形态特征一致的真菌菌落,取其中一个菌株进行观察,其菌落初呈白色,后从中央开始变为灰绿色,菌落背面为墨绿色,菌落蓬松。菌落生长迅速,生长速率达35.5 mm/d,其培养性状与已报道的葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)培养性状一致。分生孢子器球形或扁球形,大小221.2(214.2~244.8)μm×225.9(204~255)μm。分生孢子梭形、无色、单胞,大小22.6(18.7~28.6)μm×5.1(3.9~5.2)μm,其形态大小与B.dothidea的无性态七叶树壳梭孢(Fusicoccum aesculi)的分生孢子器和分生孢子形态大小相吻合;测定的rDNA-ITS、EF-1和β-tubulin 3个基因的序列长度分别为583,297,681 bp,其在GenBank中的序列登录号分别为MW202368、MW202401和MW202404,此3个序列与GenBank中葡萄座腔菌(B.dothidea)对应序列具有最高的同源性,均为100%。将本菌株的3个序列按rDNA-ITS、EF-1、β-tubulin顺序连接成一个大的串联序列,与从GenBank中下载连接的对应序列一起构建系统发育树,结果显示,该菌株与B.dothidea的各菌株聚类成一个分支,而其他种类的菌株各构成独立的分支;在人工接种试验中,该菌株能侵染桃枝条和果实,引起的症状与自然发病症状相同,并从病斑中成功进行了病菌再分离。【结论】确定从“锦绣”黄桃果实上分离到的1株葡萄座腔菌属菌株为葡萄座腔菌(B.dothidea),命名为JGT01,该菌株对桃果实和枝条均具有致病性。

放线菌活性物质的挖掘与分离技术研究进展

放线菌是一类广泛分布且备受人类关注的微生物资源,其能产生多种多样的结构新颖、具有生物活性的次级代谢产物,是多种天然产物的重要来源,具有极大的研究和开发价值。本文阐述了以生物活性为导向进行筛选挖掘、基因组挖掘、转录组挖掘等放线菌天然活性物质的挖掘手段,并结合近年研究成果分别论证各方法的优势及适用条件,为合理选择挖掘手段提供参考;概述了溶媒萃取法、离子交换层析法、薄层层析法等天然活性物质分离方法及其优缺点。文中重点综述伴随着基因组学和现代分子生物学的迅速发展而兴起的包括生物信息学分析、同源表达、异源表达等利用基因组挖掘活性物质的方法,以期为微生物资源的挖掘与利用提供相应的参考。最后合理分析目前放线菌开发利用中存在的一些问题,并简要提出相应的建议,就将来放线菌的研究方向和发展前景进行了展望。

水稻草状矮化病毒和水稻锯齿叶矮缩病毒的分子检测

【目的】明确采自福州水稻基地中水稻的病毒种类,为生产上有效防控水稻病毒病提供科学依据。【方法】从福建省福州市仓山区水稻基地采集有矮缩、黄化、分蘖增多等症状的水稻样品共9株,采用RT-PCR方法对其病原进行鉴定。根据水稻草状矮化病RGSV P6和水稻锯齿叶矮缩病RRSV P10的基因序列分别设计一对特异性引物,提取感病水稻样品和健康水稻叶片的总RNA,并进行RT-PCR扩增和测序。【结果】在9株水稻样品中,均扩增到500 bp左右的片段,与RGSV预期片段大小一致;有1株同时扩增到750 bp左右的片段,与RRSV预期片段大小一致,而健康水稻中均未扩增到相关条带。【结论】水稻病毒田间的毒源种类比较多,也常常出现复合侵染和隐症现象,因此仅通过病害症状表现很难诊断病毒病,需借助分子生物学手段才能作出正确的诊断。RT-PCR鉴定结果表明采集的9株矮缩水稻样品均感染RGSV,有一株复合感染RRSV。水稻病毒病病原的鉴定将为水稻病害的防治提供参考依据。

江西奉新猕猴桃炭疽病病原菌鉴定

猕猴桃为猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)多年生落叶藤本果树。猕猴桃营养丰富、风味独特,是当今世界新兴水果之一。江西省奉新县是我国猕猴桃主要产地之一,近年来,随着其种植规模的不断扩大,猕猴桃病害问题也日趋凸显[1]。2021年9月,该县山口基地有0.2公顷“金艳”猕猴桃发生炭疽病,全园多点发病,一些重病株病叶率超过70%,并出现大量落叶,对猕猴桃产量和品质造成严重影响。