基于溶酶体钙离子通道TRPML1探讨罗哌卡因在诱导心肌细胞自噬性凋亡中的作用机制

目的:基于溶酶体钙离子通道瞬时受体电位粘脂素亚家族1(TRPML1)探讨罗哌卡因在诱导心肌细胞自噬性凋亡中的作用机制。方法:将H9c2心肌细胞分为对照组、ROP诱导组、罗哌卡因+TRPML1抑制剂(1.25μmol/L ML-SI1)、罗哌卡因+活性氧(ROS)清除剂(100μmol/L NAC)组。CCK-8检测各组细胞增殖活性;Annexin V-APC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;流式细胞术检测ROS含量和钙离子水平;免疫荧光双染LC3与LAMP-1,观察自噬小体与溶酶体膜蛋白的共定位情况;Western blot检测凋亡相关(Caspase-3、cleaved Caspase-3)、自噬相关(LC3-Ⅱ/Ⅰ、P62)蛋白表达情况。结果:与对照组相比,罗哌卡因诱导组细胞增殖活性降低,细胞内ROS和钙离子含量升高(P<0.05);当TRPML1表达被抑制时,能够降低细胞内ROS和Ca^(2+)水平,同时减少自噬小体的蓄积,改善细胞凋亡。结论:局麻药罗哌卡因通过激活ROS/TRPML1途径致自噬流受阻,从而引起ROS、Ca^(2+)和自噬小体的过度累积,导致心肌细胞出现凋亡。

改良LAMP法检测转基因作物

目的建立简易的可视化环介导等温扩增(LAMP)检测转基因作物的方法。方法通过一对特异的能识别一段正义链和一段反义链的内引物和一对链置换引物,在Bst DNA聚合酶作用下,以等温条件实现对外源转基因成分的扩增,反应液和高浓度的显色液SYBR GREENⅠ同时置于特殊设计的反应管中,反应后可实现闭管可视化检测。结果对转基因作物中常见的外源基因元件胭脂碱合成酶终止子(T-NOS)和烟草花叶病毒35S启动子(P-CaMV35S)进行了LAMP检测。T-NOS LAMP对大米品系BT63,玉米品系BT11,MON810,大豆品系GTS40-3-2的检测结果呈阳性,P-CaMV35S LAMP对大米品系BT63,玉米品系BT11,MON810,MON863,大豆品系GTS40-3-2的检测结果呈阳性,二者对非转基因大米,玉米,大豆的检测结果均呈阴性。上述结果表明,本文中建立的T-NOS和P-CaMV35S LAMP检测方法特异性高。另外,通过对大豆品系GTS40-3-2模拟样品的检测,证明T-NOS LAMP能检出转基因成分含量为0.5%的样品,P-CaMV35S LAMP能检出转基因成分含量为0.1%的样品,检测灵敏度较高。结论改良LAMP法灵敏度高,特异性好,能用于快速初筛转基因作物。