犬肺表面活性蛋白A的克隆及其在昆虫杆状病毒系统的表达

利用RT-PCR方法扩增犬肺表面活性蛋白A(canine lung surfactant protein A,cSP-A)基因,将其连接至p MD18-T载体,经测序正确后,使用DNAMAN软件比对不同种属SP-A基因序列;将cSP-A基因片段经双酶切后连接至pFastbac1载体得到pFastbac1-cSP-A;再将其转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒,然后转染sf9细胞得到P1代重组杆状病毒P1 rBv-cSP-A,P1代病毒连续扩增3代后,取P4 rBv-cSP-A感染sf9细胞表达cSP-A重组蛋白,利用蛋白免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定表达产物。结果显示cSP-A基因大小为699 bp;不同种属间SP-A的C末端碳水化合物识别结构域的同源性为49.1%~95.5%;经Western Blot和IFA鉴定,重组cSP-A蛋白在细胞内表达未分泌到胞外,分子量大小约为31.84 kDa。