磁性壳聚糖微球的合成及其在固定化血管紧张素转化酶的应用

以化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子为磁核,采用乳化交联法制备磁性壳聚糖微球,并对其形貌、结构和磁饱和强度等性质进行了表征。以磁性壳聚糖微球作为载体,固定化猪肺粗提物中的血管紧张素转化酶,并对固定化条件进行研究。结果表明,固定化血管紧张素转化酶的最佳条件为:pH值为8.3,最佳温度为50℃,最佳时间为1.5 h,最佳酶溶液蛋白浓度为6 mg/mL,此时固定化酶活力最高为0.048 U/g微球。与游离酶相比,固定化酶的pH值稳定性和热稳定性均得到提高。固定化酶重复使用10次,仍然保持40%以上相对活力,说明磁性壳聚糖微球是固定化血管紧张素转化酶的良好载体。

猪肺血管紧张素转化酶纯化工艺中试放大研究

采用DEAE离子交换层析-超滤法纯化猪肺血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE),在小试工艺条件的基础上对DEAE离子交换层析进行中试放大。以ACE比活及酶活回收率为指标,考察工艺放大后的纯化效果,并进一步完善纯化工艺条件。结果表明,DEAE离子交换层析柱放大15倍后,最终得到的ACE比活为(1.05±0.04)U/mg,达到电泳级纯,与小试工艺的纯化结果无明显差异,酶活回收率为34.6%±0.3%,高于小试工艺。由此认为,猪肺ACE提取放大纯化工艺是可行的,且可提高纯化效率,该工艺为更大规模的纯化ACE奠定了基础。

等温滴定量热法测定酶催化反应的热动力学参数

采用等温滴定量热法(ITC)测定猪肺血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)催化水解其体外模拟底物马尿酰-组氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL)反应的热动力学参数,考察了温度对动力学参数的影响。结果表明,该反应的摩尔水解焓ΔH_(hydr)为正值,是吸热反应,且随温度升高ΔH_(hydr)增大,等压比热容c_p为0.2126k J/(mol·K);ACE催化HHL的水解反应符合Michaelis-Menten机理,在实验温度范围内(298.15~313.15K),米氏常数K_m随温度升高而减小,催化常数kcat随温度的升高先增大后减少,在308.15K时达到最大值2.534s^(-1)。将该法与传统的初始速率法进行比较,传统法存在的局限性使测得的K_m相对偏大。同时使用ITC结合动力学分析测得ACE抑制剂药物依那普利拉为竞争性抑制剂,抑制常数K_I为12.1 nmol/L,与文献比较证明该法可用于抑制剂类型的判断,是一种开发ACE抑制剂的新方法。应用该方法确定活性多肽Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr(RY-5)为非竞争性抑制剂,抑制常数K_I为1.0μmol/L。

固定化Cu^(2+)磁性壳聚糖微球的制备及应用研究

采用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米颗粒,乳化交联法制备磁性壳聚糖微球。以环氧氯丙烷为活化剂,螯合铜离子制备了固定化Cu2+的磁性壳聚糖微球(Cu2+-IDA-MCS)为亲和介质。以乳源蛋白中发现的血管紧张素转化酶抑制肽(ACEI)Val-Ser-Leu-Pro-Glu-Try(VSLPEW)为模型分子,考察了Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW的吸附效果。结果表明,固定化Cu2+的磁性壳聚糖微球吸附VSLPEW的最佳条件为:VSLPEW的初始浓度为2.0mg/mL,亲和介质的吸附时间为40min,吸附温度为30℃,缓冲液pH值为7.5,此时Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW的最大吸附量达49.08mg/g。说明Cu2+-IDA-MCS是吸附VSLPEW的一种有效的亲和介质。