miR-146调控TLR4/NF-κB通路减少卵泡颗粒细胞凋亡及干预卵巢早衰中的机制研究

目的探究miR-146通过调控Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)减少卵泡颗粒细胞凋亡和干预卵巢早衰(premature ovarian failure,,POF)的机制。方法野生小鼠实验:60只SPF级C57BL/6小鼠随机分为对照组(n=30)和POF组(n=30)。POF组建立卵巢早衰模型,造模后15天qPCR检测2组小鼠卵巢组织中miRNA-146表达水平;基因敲除鼠实验:40只C57BL/6小鼠和20只miR-146敲除小鼠分为三组:对照组(n=20)、野生型POF组(n=20)和miR-146敲除POF组(n=20),野生型POF组和miR-146敲除POF组建立POF模型,建模后15天HE染色分析各组小鼠卵巢组织病理情况及原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡数,ELISA检测各组小鼠卵巢组织炎症信号通路分子TLR,NF-κB,肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的表达水平;Western blot检测卵巢组织凋亡蛋白BCL2-Associated X蛋白(Bax),B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl2)和TLR4信号通路蛋白TLR4,NF-κB表达水平。结果野生鼠实验表明与对照组相比,POF组小鼠卵泡中miR-146表达水平下调(0.51±0.14 vs 1.52±0.21),差异具有统计学意义(t=7.338,P<0.01);基因敲除鼠实验表明:与对照组相比,野生型POF组和miR-146敲除POF组原始卵泡(9.43±2.03,6.43±1.60 vs 16.82±2.11)、初级卵泡(6.15±1.11,5.01±1.10 vs 8.88±1.12)、次级卵泡(5.11±1.71,4.01±1.26 vs 7.11±1.34)均降低,闭锁卵泡(10.17±1.41,11.46±1.96 vs 7.18±1.64)升高,差异具有统计学意义(F=7.787,8.214,9.726,7.811,均P<0.01)。与对照组相比,野生鼠POF组和miR-146敲除POF组小鼠卵巢组织TLR4(68.18±5.92pg/ml,91.11±16.34 pg/ml vs 24.81±2.81 pg/ml),NF-κB(74.19±8.11 pg/ml,88.11±16.71pg/ml vs 68.18±5.92 pg/ml),TNF-α(72.81±2.10 pg/ml,94.31±2.26 pg/ml vs 28.07±3.67 pg/ml)和IL-6(69.19±7.11,81.11±16.34 vs 19.43±10.81 pg/ml)分泌显著升高,差异均有统计学意义(F=6.281,7.264,8.724,6.817,均P<0.01);与对照组相比,野生鼠POF组和miR-146敲除POF组小鼠卵巢组织Bax蛋白表达水平降低(1.18±0.19.0.61±0.14 vs1.81±0.21),Bcl2蛋白表达升高(0.59±0.05,0.91±0.05 vs 0.58±0.02),TLR4(1.10±0.12,0.41±0.04 vs 1.13±0.11)和NF-κB(0.81±0.02,0.31±0.06 vs 0.87±0.27)降低,差异均有显著性统计学意义(F=7.235,6.714,7.612,7.737,均P<0.01)。结论miR-146具有减少卵泡颗粒细胞凋亡的作用,其机制可能与TLR4/NF-κB信号通路的调控和抑制炎症因子的释放相关。

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5·58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdxMSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdxMSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础。

血液流变学在常见几种疾病检测中的临床意义

对 2 42例 8种疾病患者血液进行血液流变学指标测定 ,并与 40名体检健康者血液作比较分析 ,结果显示 ,临床常见的高血压、糖尿病、脑梗塞、脑动脉硬化、冠心病、慢性支气管炎、肺炎及脑中风等八种疾病的血液流变性都存在异常变化。提示在临床上可通过血液流变学指标的检查来帮助预防、诊断和治疗这些疾病。

人单纯疱疹病毒1型VP22介导的microdystrophin重组腺病毒的构建及其蛋白转导特性

目的构建含有人单纯疱疹病毒1型(HSV-1)VP22与人microdystrophin基因融合的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,探讨VP22对microdystrophin基因在成肌细胞中的蛋白转导特性。方法设计引物,从质粒pSIN-rep5-VP22中扩增VP22全长基因,然后将VP22基因定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pCMV-VP22;再用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-micro质粒,获得microdystrophin基因,片段回收后定向插入重组质粒pCMV-VP22,获得重组质粒pCMV-VP22-MICDYS。PmeI线性化重组质粒pCMV-VP22-MICDYS,去磷酸化后回收与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组腺病毒。将含VP22-microdystrophin及microdystrophin的病毒上清分别转染成肌细胞C2C12,通过RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学方法检测microdys-trophin的mRNA及蛋白表达。结果成功构建了含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒,体外感染成肌细胞C2C12,Western-blot及免疫组织化学检测显示VP22显著提高了microdystrophin蛋白在C2C12细胞中的表达。结论含有VP22-microdystrophin基因的重组腺病毒载体的构建及VP22介导microdystrophin在成肌细胞C2C12间的转导,为利用此病毒进行假肥大型肌营养不良症疾病的治疗研究奠定了基础。

医学遗传学课堂教学与临床应用相结合的教学探讨

随着时代的发展，医学遗传学的临床应用越来越重要，怎样将医学遗传学课堂教学与临床应用有机地结合起来是如今教学面临的一个重要问题，结合医学遗传学学科发展和教学体会在此方面做一些探讨，为医学遗传学的课堂教学提出一些建议。

大学教学中PPT制作的几点体会

随着多媒体教学的日益普及,现在大学课堂教学基本都以PPT作为重要教学手段,但由于不同教师PPT制作质量的差异,在教学中会产生不同的教学效果。在听取了部分教师的讲课、走访了部分学生对教师PPT制作的意见,并结合自身医学遗传学教学中制作PPT的经验,谈谈对于大学教学中PPT制作的几点体会。

伪狂犬病诊断方法的研究进展

伪狂犬病是猪、牛、羊等多种家畜和野生动物的一种急性传染病,迄今已在全世界四十多个国家广泛发生,在我国,已有二十多个省份相继流行此病,给养猪带来巨大的经济损失。由于该病的临床症状与其它繁殖障碍综合征的疾病非常相似,因此仅凭流行病学和临床症状很难作出确诊,需要借助多种实验室诊断技术和手段。本文综述了近年来对该病病原学,血清学及鉴别诊断等诊断方法的进展,介绍了不同方法的优点和缺点,可供各地应用时的参考。

表达猪细小病毒VP_2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究

根据Bergeron等报道的猪细小病毒(PPV)基因组,设计一对包含VP2全基因的PCR引物,上下游均引入一个BamHⅠ位点,扩增得到VP2基因后,将其插入到pUSK载体中,构建了转移载体pUSK VP2。采用脂质体介导的转染方法,将伪狂犬病毒TK-/gG-/LacZ+株的基因组DNA与pUSK VP2共转染PK 15细胞,待细胞病变后收集病毒液,在空斑纯化的同时,利用检测PPVVP2基因和LacZ基因的PCR方法筛选重组病毒TK-/gG-/VP+2株,Southernblotting、SDS PAGE、Westernblotting和电镜观察鉴定重组病毒,并在不同细胞上测定重组病毒的增殖滴度,接种小鼠进行安全性试验。结果发现,外源基因VP2已成功地插入到TK-/gG-/LacZ+亲本株的基因组中,并获得了表达。表达的VP2蛋白可以与猪细小病毒阳性血清反应,而且可以自行装配成病毒样颗粒。同时发现,VP2基因的插入不影响重组病毒的增殖特性,其毒力与亲本株相当。

表达绿色荧光蛋白伪狂犬病病毒转移载体的构建及转移特性

对含伪狂犬病病毒 ( PRV)鄂 A株 g G全基因 ,PK、g D基因部分编码序列的质粒 p USK进行改造 ,消除其中的 Eco R 位点 ,将通过 PCR扩增的增强绿色荧光蛋白基因 ( EGFP)融合到 g G启动子下游 ,构建了由 g G启动子控制 EGFP表达的 PRV转移载体 pg G- /EGFP+。该转移载体单独转染或同 PRV基因组 DNA共转染 IBRS-2细胞 ,结果单独转染时 EGFP不能表达 ;共转染时 ,6 h就可在荧光显微镜下观察到明显的荧光。

单纯男性因素不育患者行形态选择性卵胞浆内单精子注射对胚胎发育及临床结局的影响

目的使用放大系统对不育男性患者的精子进行形态选择性卵母细胞浆内单精子注射术（IMSI）,观察IMSI技术能否改善因男性精液问题而不孕不育夫妇的助孕结局。方法回顾分析本中心2013年1月-2014年11月共82例梗阻性无精子症患者,将行TESA（经皮睾丸穿刺抽吸精子术）获得的睾丸精子通过放大系统（×6600）挑选后行卵母细胞注射（IMSI组）,2013年1月-2014年11月共91例梗阻性无精子症患者经TESA取精术后行常规卵母细胞浆内单精子注射（ICSI组）;2014年1月-11月共44例畸精子症患者行形态选择性包浆内单精子注射治疗（IMSI组）,2014年1月-11月共71例畸精子症患者行常规ICSI治疗（ICSI组）。统计分析ICSI组和IMSI组患者的实验室结局和临床结局。结果梗阻性无精子症患者中正常受精率IMSI组显著高于ICSI组（84.3%vs 77.0%）（P〈0.05）;ICSI组的卵裂率95.5%,优胚率28.2%,囊胚形成率54.8%,种植率26.4%,临床妊娠率47.3%,流产率14%,梗阻性无精子症IMSI组患者的卵裂率96.7%,优胚率29.2%,囊胚形成率54.3%,种植率32.3%,临床妊娠率50.0%,流产率7.3%,两组无显著性差异（P〉0.05）。畸精子症患者的正常受精率IMSI组显著高于ICSI组（68%vs 75.5%）（P〈0.05）,囊胚形成率IMSI组显著高于ICSI组（54.6%vs 67.9%）（P〈0.05）,ICSI组的卵裂率96.2%,优胚率27.6%,种植率28.2%,临床妊娠率43.7%,流产率9.7%;IMSI组患者的卵裂率95.2%,优胚率27.1%,种植率30.7%,临床妊娠率43.2%,流产率10.5%,两组无显著性差异（P〉0.05）。结论梗阻性无精子症患者的睾丸精子经放大系统选择后行ICSI,正常受精率较传统ICSI有显著性提高;畸精子症患者射出的精液标本经放大系统挑选后行ICSI,正常受精率、囊胚形成率较传统ICSI有显著性提高。

伪狂犬病基因缺失疫苗研究进展

伪狂犬病是由疱疹病毒科α-疱疹病毒亚科猪疱疹病毒I型的伪狂犬病毒引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是本病病毒的天然宿主和贮存者,本病可引起猪严重的繁殖障碍,给我国乃至全世界的养猪业造成巨大经济损失。采取安全有效的疫苗进行免疫预防,是控制该病的主要手段。

异体骨髓干细胞移植后假肥大型肌营养不良症模型鼠膈肌dystrophin表达及病理改变

目的探讨骨髓干细胞移植对假肥大型肌营养不良症(DMD)模型鼠-mdx鼠膈肌的治疗效果。方法取雄性SD大鼠骨髓干细胞经尾静脉植入放疗处理后的8周龄雌性mdx鼠(n=18)。于移植后4、8、12周各取6只mdx鼠的膈肌行 HE染色、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)免疫荧光检测以及dystrophin mRNA的RT-PCR分析,同时用正常C57鼠及放疗而未移植的mdx鼠作为对照,另进行PCR反应检测实验鼠膈肌内Sry(Y染色体的性别决定区)基因。结果移植后mdx 鼠膈肌间质内炎性细胞浸润较放疗而未移植mdx鼠有所减少;移植后核中心移位纤维比例[移植后4、8、12周分别为 (15．58±0．91)％、(12．50±1．87)％、(10．17％±1．17)％]较未移植mdx鼠(19．5±1．87)％显著减少。移植后dystrophin免疫荧光阳性细胞比例[移植后4、8、12周分别为(1．00±0．32)％、(6．00±1．05)％、(11．92±1．11％)]较未移植mdx鼠(O．17±0．41)％显著增加。RT-PCR结果显示C57鼠膈肌的dystrophin mRNA相对含量(0．63±0．04)最高;而未移植mdx鼠的膈肌中未检测到dystrophin mRNA;移植后的mdx鼠膈肌中mRNA的表达水平(移植后4、8、12周分别为0．19±0．05、0．26±0.06、0．36± 0．04)随时间推移逐渐增高;移植后各时间点mdx鼠膈肌Sry基因均为阳性。结论骨髓干细胞系统移植mdx鼠可以恢复部分膈肌的dystrophin表达,改善膈肌的病理,骨髓干细胞移植有希望成为全身治疗DMD的有效方法。

人骨髓间充质干细胞移植促进脑梗死大鼠神经细胞再生和神经功能恢复

背景：有研究表明,骨髓间充质干细胞或神经干细胞同种移植可改善脑梗死模型鼠神经功能。目的：观察人骨髓间充质干细胞在移植大鼠脑神经功能梗死局部的内存活、迁移情况及神经细胞再生。方法：将人骨髓间充质干细胞经静脉注入免疫抑制的大脑中动脉闭塞模型大鼠,每周观察、记录移植大鼠的行为和神经功能状况（NSS评分、转棒实验）;于移植后1~8周处死大鼠,采用免疫组织化学染色,免疫荧光染色和RT-PCR检测检测移植大鼠大脑人细胞核抗原、神经干细胞标志物（巢蛋白）及神经细胞标志物（神经元核心抗原、脑型微管蛋白、胶质纤维酸性蛋白）的表达。结果与结论：骨髓间充质干细胞移植后2周,脑梗死模型鼠NSS评分明显降低（P〈0.05）、转棒实验停留时间明显延长（P〈0.01）,神经功能得到改善（P〈0.05）。人骨髓间充质干细胞移植后1~8周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围均可检测到人细胞核抗原阳性细胞。移植后一二周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回（CA1,CA3区）、梗死灶周围可见部分巢蛋白阳性细胞和mRNA表达,存续至8周。移植后2周,在移植大鼠病变侧室管膜下区、海马齿状回、梗死灶周围可见部分神经元核心抗原、脑型微管蛋白阳性细胞和mRNA的表达。移植后4~8周,在海马、梗死灶周围可见少量胶质纤维酸性蛋白阳性细胞和少量mRNA的表达。结果证实,静脉移植人骨髓间充质干细胞能在脑梗死模型大鼠脑内存活、并迁移至病变部位,继而分化为神经细胞,促进新生神经细胞的形成,改善移植大鼠的神经功能。

杆状病毒转导不同哺乳动物骨髓来源间充质干细胞

杆状病毒作为一种新型基因载体,若能有效转导不同哺乳动物骨髓来源间充质干细胞(bone marrow-derived mesen-chymal stem cells,BMSCs),将会成为干细胞基因修饰研究领域中更理想的一种基因载体。本文探讨了重组杆状病毒(BacV-CMV-EGFP)对不同哺乳动物BMSCs的转导效率。体外原代培养小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs。用培养3代以上的哺乳动物BMSCs进行病毒转导实验,转导2d后用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在不同哺乳动物BMSCs中的表达,并用流式细胞仪检测重组杆状病毒对不同哺乳动物BMSCs的转导效率。结果显示:原代培养的小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs于体外传代3次以上后,细胞呈现较均一的梭形,漩涡状生长;倒置荧光显微镜观察显示,与小鼠、大鼠、猪的BMSCs相比,恒河猴及人有更多BMSCs表达绿色荧光蛋白,且荧光强度较强;杆状病毒对小鼠、大鼠、猪、恒河猴及人的BMSCs的转导效率分别为(21.21±3.02)%﹑(22.51±4.48)%﹑(39.13±5.79)%﹑(71.16±5.36)%及(70.67±3.74)%。上述结果表明,重组杆状病毒对不同哺乳动物BMSCs的转导效率不同,对恒河猴及人的BMSCs转导效率较高,说明重组杆状病毒可作为人或灵长类动物BMSCs基因修饰研究领域中更理想的基因载体。

家族性肌萎缩侧索硬化症转基因鼠的繁殖和鉴定

目的建立家族性肌萎缩侧索硬化症(FALS)转基因模型鼠的繁育方法,并对其子代鼠进行基因鉴定。方法(1)以6只B6SJL SOD1G93A/+半合子雄鼠与6只B6SJLF1/J+/+雌鼠(1∶1)交配;(2)由鼠尾血提取基因组DNA,PCR扩增hmSOD1基因的片段,电泳后观察结果;(3)对PCR产物进行纯化测序,并通过BLAST验证。结果6对种鼠交配产鼠仔53只,存活率为98%(52/53);G93A hmSOD1阳性鼠约占44.2%(23/52);PCR扩增产物分别为内对照(IL-2):324 bp;Tg(hmSOD1):236 bp;测序证实PCR产物的基因序列和hmSOD1基因片段中的序列一致,并存在G93A突变。结论B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠配种能成功繁育出Tg(hmSOD1)阳性的ALS半合子子代鼠;本实验的PCR法能准确鉴定hmSOD1基因阳性鼠,并证实该转入的基因按近似孟德尔方式遗传,为ALS实验研究奠定了基础。

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的构建人微小抗肌萎缩蛋白基因(microdystrophin)的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究其体外表达情况。方法限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒pcD-NA3.1(+)的NotI位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3.1(+)/micro dystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入rMSCs中,经过G418筛选后,用RT-PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果pcDNA3.1(+)/micro dystrophin经过NotI、Hind III酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录;对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光,说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染入rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达,为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。

RT-PCR在鸡传染性法氏囊病诊断中的应用

为探讨本实验室建立的RT -PCR法对目前流行的鸡传染性法氏囊病的诊断效果 ,采用该法对 7个养鸡场的 12个病死鸡法氏囊标本进行了检测 ,诊断为传染性法氏囊病毒感染。检出率达 10 0 % ,无假阳性现象发生。结果表明 ,本检验方法对目前流行的超强毒株和变异株均有很高的灵敏度和特异性 ,可以在兽医临床工作中推广使用。

逆转录-聚合酶链反应诊断IBDV的免疫后感染

用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对 5个养鸡场的 13份病死鸡腔上囊、腺胃标本进行了检测 ,诊断为免疫后感染传染性腔上囊病毒 (IBDV) 。

创新驱动引领下的广东省遗传学研究

遗传学(genetics)是探究生物遗传和变异规律的科学。从1866年孟德尔发表“植物杂交实验”论文,标志着经典遗传学的创立;到1953年沃森和克里克提出DNA双螺旋结构模型,开启了分子遗传学研究的大门;随着分子生物学的发展和多学科交叉融合,以PCR技术、DNA重组技术、高通量基因组测序技术、基因编辑技术及生物信息大数据平台等为代表的一系列新技术和新方法取得飞速发展和革命性突破。现代分子遗传学已经发展成为生命科学和医学研究领域中最重要的基础性和前沿性核心学科之一。